Направленные изменения спектральных свойств флуоресцентных белков в живой клетке как инструмент изучения функционирования белков

• Автор: Чжан Лицзюань
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 107 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Используемые сокращения

I. ВВЕДЕНИЕ

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

II.1. Фотоактивируемые флуоресцентные белки

IL1.1. PA-GFP

11.1.2. PS-CFP

11.1.3. PA-mRFPl

11.1.4. PAmCherryl, PAmCherry2 и РАтСЬеггуЗ

II.1.6. RsCherry и rsCherryRev

П.1.7. Dronpa
11.1. 8. Мутантные варианты белка Dronpa
II. 1.9. mTFP0
11.1.10. Kaede
11.1.11. Kaede-подобные белки
11.1.12. IrisFP
11.1.13. Свойство фотопереключения красных флуоресцентных белков
II.2 Флуоресцентная микроскопия со сверхвысоким разрешением
11.2.1. Разрешающая способность микроскопа
11.2.2. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия
11.2.3. 4Pi и 15М микроскопия
11.2.4. STED микроскопия
11.2.5. RESOLFT

11.2.6. Методы флуоресцентной микроскопии высокого разрешения на уровне одной молекулы

11.2.8. Многоцветное изображение с высоким разрешением
II.3. Убиквитин - протеасомная система
IL3.1. Система убиквитинирования
II.3.2. Строение 26S-npoTeacoMbi
И.3.3. Регуляторные субкомплексы протеасомы
11.3.4. Внутриклеточная локализация протеасом
11.3.5. Сигналы деградации
11.3.6. Методы определения времени полужизни белков in vivo
П.4. Флуоресцентный резонансный перенос энергии
II.4.1. Способы измерения FRET
III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
III.1. Оборудование
111.2. Реактивы
111.3. Использованные методы
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
IV. 1. Разработка метода мониторинга деградации целевых белков с использованием необратимо фотоактивируемых флуоресцентных белков
IV. 1.1. Описание предлагаемого метода
IV.1.2. Подбор условий для визуализации, фотопереключения и наблюдения за белком Dendra2 в клетках млекопитающих
IV.1.3. Влияние PEST-мотивов и убиквитина на время жизни белка Dendra2 в клетке
IV.1.4. Определение времени полужизни белка 1кВа при помощи Dendra2
ІУ.2. Получение и использование мономерных обратимо фотоактивируемых красных флуоресцентных белков
ІУ.2.1. Получение мономерного обратимо фотопереключаемого красного флуоресцентного белка КТТ-НС
ГУ.2.2. Спектральные свойства КТР-НС
ІУ.2.3. Фотоконверсия ЮТ-НС в культуре клеток млекопитающих90
ІУ.2.4. Получение обратимо фотопереключаемого красного флуоресцентного белка гвТаёМПР
ІУ.2.5. Характеристика выделенного rsTagRFP в растворе
IV 2.6. Применение rsTagRFP для изучения белок-белковых взаимодействий в живой клетке
V. ВЫВОДЫ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

на значительное усложнение техники измерений и обработки результатов, новые методы получили широкое распространение. Развитие генной инженерии, протеомики, биотехнологии, современной фармацевтики и биомедицины способствовало быстрому внедрению новых методов оптической микроскопии (Феофанов, 2007).
И.2.1. Разрешающая способность микроскопа
Качество изображения определяется разрешающей способностью микроскопа, т.е. минимальным расстоянием, на котором оптика микроскопа может различить две близко расположенные точки. Разрешающая способность зависит от числовой апертуры объектива, конденсора и длины волны света, которым освещается препарат. Числовая апертура зависит от угловой апертуры и показателя преломления среды, находящейся между фронтальной линзой объектива и конденсора и препаратом. Угловая апертура объектива - это максимальный угол, под которым могут попадать в объектив лучи, прошедшие через препарат. Числовая апертура объектива равна произведению синуса половины угловой апертуры на показатель преломления среды, находящейся между предметным стеклом и фронтальной линзой объектива. N.A. = п sina где, N.A. - числовая апертура; п - показатель преломления среды между препаратом и объективом; sina - синус угла а, равного половине угла конуса падающего фокусирующего света, проходящего через объектив. Разрешающая способность микроскопа зависит также от апертуры конденсора. Если считать апертуру конденсора равной апертуре объектива, то формула разрешающей способности имеет вид R-/./2NA, где R - предел разрешения; X - длина волны; N.A -числовая апертура (Huang et al., 2009).
В случае флуоресцентного микроскопа, при наблюдении в видимом свете (зеленый участок спектра - л=550нм), разрешающая способность (предел разрешения) микроскопа в латеральной плоскости не может быть больше 200 нм, а в аксиальной — 500 нм.
Сейчас принято оценивать разрешающую способность по ширине функции размывания точки на половине высоты: FWHM (Full Width at Half Maximum) от PSF -функция рассеяния точки (Point Spread Function). Функцией рассеяния точки называют трехмерное распределение интенсивности образа точечного объекта.