Изучение разнообразия и эволюции генов TAS3, кодирующих предшественники ta-siРНК у нецветковых наземных растений и особенности их экспрессии у некоторых покрытосеменных

• Автор: Красникова, Мария Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 94 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Развитие исследований РНК-сайленсинга у растений: микроРНК и транс-действующие малые РНК
1.2. Функции 1а-з1ШМА растений
1.3. Изучение микроРНК и 1а-81РНК мхов и их функций
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Растительный материал
2 2. Выделение ДНК
2.3. Агробактериальная трансформация и агроинфильтрация
2.4. Выделение РНК и синтез кДНК
2.5. Амплификация и электрофорез
2.6. Клонированние фрагментов ДНК
2.7. Секвенирование
2.8. Вычислительный анализ последовательностей
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Разнообразие генов ТАБЗ и их дифференциальная
экспрессия у некоторых растений рода №сойапа
3.2. Разнообразие генов ТАБЗ и их дифференциальная
экспрессия у некоторых растений в подтрибе Зепесюшпае
3.3. Разнообразие генов гшК390 у некоторых мхов и печеночников
3.4 Детекция генов ТА83 у нецветковых высших растений
- мохообразных, папоротникообразных и голосеменных
3.5. Принципы эволюции генов ТА83 у наземных растений
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
ПРИЛОЖЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Малые некодирующие РНК у эукариот это обычно 20-25-и нуклеотидные последовательности участвующие во многих биологических процессах. У растений они играют важнейшую регуляторную роль в процессе роста и дифференцирования тканей, в формировании гетерохроматина, деградации мРНК, подавлении экспрессии генов, а также в ответе на разнообразные типы стрессов.
Эта роль осуществляется комплементарным связыванием малых некодирующих РНК со специфическими мРНК-мишенями, ведущим к посттранскрипционному РНК-сайленсингу соответствующих генов [Baulcombe, 2004; Carrington and Ambros, 2003; Voinnet, 2005; Vaucheret, 2006; Bonnet et al., 2006; Chu and Rana, 2007].
К основным видам малых РНК относятся микроРНК (miPHK), короткие интерферирующие РНК (siPHK) и транс-действующие siPHK (ta-siPHK).
Микро РНК (miPHK) представляют собой класс малых некодирующих РНК (из 21-22 нуклеотидов), транскрибируемых из геномов всех многоклеточных организмов и некоторых вирусов [Jones-Rhoades and Bartel, 2004; Laporte et al., 2007; Liu et al., 2007].
Биогенез растительных miPHK начинается с транскрипции предшественников микроРНК РНК-полимеразой 11. Эти предшественники содержат последовательность зрелой микроРНК внутри длинной несовершенной шпильки, которая обрабатывается в ядре белком DCL1 [Rogers and Chen, 2013]. В настоящее время описаны, в общей сложности, несколько десятков семейств растительных микроРНК (сотни отдельных видов микроРНК), а также, найдены их мишени - в основном белок-кодирующие мРНК. Но некоторые микроРНК руководят расщеплением некодирующих первичных транскриптов TAS генов направляя формирование трансдействующих siPHK. В этом случае, микроРНК выполняют расщепление с помощью белка Argonaute (AGO), который расщепляет одноцепочечный TAS

РНК транскрипт в области, комплементарной малой РНК. Продукты расщепления TAS преобразуются в результате совместного действия белка SGS3 и РНК-полимеразы RDR6 в двухцепочечную форму, а затем обрабатываются DCL4 для получения ta-siPHK, которые располагаются с шагом в 21 нт по отношению к исходному сайту расщепления на обеих цепях.
Получившиеся 21-нуклеотидные ta-siPHK далее работают в качестве компонентов комплекса RISC для направления AGO-зависимого расщепления их мишени.
Особенность их действия связана с тем, что они функционально инактивируют in trans не те гены, которыми кодируются (TAS гены), а иные гены, в основном кодирующие регуляторные белки.
Для высших растений характерны ta-siPHK, которые кодируются собственными генами (TASla, TASlb, TASlc, TAS2, TAS3 и TAS4). Большинство предшественников TAS РНК имеют только один мотив микроРНК (например, miR173), расположенный на 5'-конце ta-siPHK предшественника, и этот мотив расщепляется AG01 руководствуясь соответствующей микроРНК. Однако для расщепления предшественника TAS3 РНК, необходимо два сайта miR390 (на 5' и 3' концах фрагмента). Образование таких ta-siPHK зависит от специфичного взаимодействия между AG07 и miR390 [Montgomery et al., 2008; Endo et al., 2013]. Впоследствии они контролируют активность генов ауксин-регулируемых транскрипционных факторов ARF3 и ARF4, направляя специфическую деградацию их мРНК, поэтому их назвали ta-siARF РНК [Allen et al., 2005; Carraro et al., 2006; Nogueira et a., 2007].
Важнейшее значение TAS3 генов в регуляции развития растения, их широкая распространенность даже у примитивных наземных растений и слабая изученность эволюции и разнообразия гшК390-зависимых TAS генов требуют новых подходов и специальных исследований в этом направлении [Allen et al., 2005; Nogueira et al., 2007].

37° С и 230 RPM в течение 90 минут. Далее клеточную суспензию охлаждали в течение 30 мин. и собирали клетки центрифугированием на центрифуге К-23 при 4000 оборотах в минуту, и 4° С в течение 20 минут. Супернатант тщательно удаляли и ресуспендировали клетки в 1/10 объема исходного раствора буфером TSS (LB бульон, 40% водный раствор полиэтиленгликоля (6000) - 10%, DMSO - 5%, MgC12 - 20mM, MgS04 - 20тМ, pH 6.5) [Chung et al., 1989]. Затем клетки инкубировали во льду 30 мин. Хранили клетки при -70° С.
Трансформацию E.coli плазмидной ДНК проводили в соответствии с описанными методиками [Sambrook et al., 1984]. Скрининг бактериальных колоний проводился методом ПЦР с использованием универсальных праймеров F 5 '-GTAAAACGACGGCCAGT-3' и R 5 '-CAGGAAACAGCTATGAC-3',
продукты реакции разделяли методом электрофореза.
2.7. Секвенирование
Фрагменты, полученные в результате амплификаций, использовались в качестве матриц для определения нуклеотидных последовательностей методом циклического секвенирования с использованием реагентов ABI PRISM® BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer в Центре коллективного пользования «Геном» (Институт Молекулярной Биологии РАН им. В.А.Энгельгардта). Полученные последовательности депонированы в банк данных NCBI. Присвоенные банком номера указаны в тексте и в таблице I.
2.8. Вычислительный анализ последовательностей.
Выравнивание последовательностей ДНК осуществлялось вручную в программе BioEdit 7.0 [Hall, 1999]. Филогенетические деревья строили методом минимальной эволюции, реализованным в пакете MAFFT 5.6 (Multiple alignment program for amino acid or nucleotide sequences) по последовательностям, выравненым с помощью того же пакета.