Использование систем гомологичной и сайт-специфической рекомбинации фага λ для целенаправленной модификации хромосомы Pantoea ananatis

• Автор: Голубева, Любовь Игоревна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 120 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ. 6 Актуальность проблемы

Цели и задачи работы

Научная новизна и практическая значимость работы. 8 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Использование микроорганизмов для получения веществ, применяющихся в различных сферах деятельности человека

1.1. Основные этапы становления микробиологической промышленности

1.2. Микроорганизмы, традиционно используемые в микробиологической промышленности

1.2.1. Дрожжи

1.2.2. Corynebacterium glutamicum

1.2.3. Род Bacillus

1.2.4. Е. coll
1.3. Современные задачи микробиологической промышленности требуют расширения базы используемых микроорганизмов
2. Использование сайт-специфической рекомбинации и гомологичной рекомбинации фагов - новый высокоэффективный подход к целенаправленному конструированию мутаций
2. 1. «Recombineering» - генетическая инженерия бактерий с использованием фаговых систем гомологичной рекомбинации
2.1.1. Основные элементы X Red и RecET систем гомологичной рекомбинации
2.1.2. Интеграция линейных двухцепочечных и одноцепочечных фрагментов ДНК с использованием X Red и RecET систем гомологичной рекомбинации
2.2. Совместное использование X Red или RecET и систем сайт-специфической рекомбинации
2.3. Получение мутаций с удалением всех «следовых» последовательностей
2.4. Использование X Red-системы в гетерологичных хозяевах
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Штаммы
2. Плазмиды
3. Среды
4. Проведение полимеразной цепной реакции
5. Генно-инженерные методики
6. Конструирование рекомбинантных плазмид
7. Трансформация клеток P. ananatis плазмидной ДНК с помощью процедуры электропорации
8. Трансформация клеток P. ananatis геномной ДНК с помощью процедуры электропорации
9. X Red-зависимая интеграция двухцепочечных и одноцепочечных фрагментов ДНК в хромосому P. ananatis
10. Конструирование интегративных кассет
11. Секвенирование ДНК
12. Измерение активности Р-галактозидазы
13. Определение относительного количества мРНК гена lacZ P. ananatis методом ПЦР в реальном времени
14. Олигонуклеодтиды. 58 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
1. Трансформация клеток P. ananatis методом электропорации

2. Адаптация Лей-зависимой системы гомологичной рекомбинации фага X для создания целенаправленных модификаций в хромосоме Р. апапайз
2.1. Конструирование плазмиды-помощника, обеспечивающей регулируемую экспрессию генов 11ес1-системы фага X
2.2. Одновременная экспрессия генов Г1ес1-системы фага X является токсичной для клеток Р. апапайз
2.3. Селекция штамма-реципиента для осуществления X Яеб-зависимой интеграции двухцепочечных фрагментов ДНК в хромосому Р. апапайз
3. Введение множественных модификаций в хромосому Р. апапаНя с использованием комбинированной системы X Кеб-М/Хдв
4. Введение точечных мутаций в хромосому штамма 8С17(0) 77 Р. an.ana.tis.
5. Целенаправленная модификация хромосомы штамма 8С17 Р. апапайз с помощью X ВЩ-зависимой интеграции олигонуклеотидов
6. Ген |3-галактозидазы - природный репортер, локализованный в хромосоме Р. апапаИз
7. Создание охарактеризованной библиотеки промоторов для оптимизации экспрессии генов Р. апапаЙ5
8. Идентификация гена аланин рацемазы Р. апапайз и его использование в качестве репортера
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ввести целевую модификацию в (25-40) % клеток, выживших после электропарации (Costantino N.. Court D. L., 2003).
2.2. Совместное использование X Red или RecET и систем сайт-специфической рекомбинации.
В 90-е годы прошлого века были созданы различные интегративные кассеты, содержащие гены антибиотической устойчивости, которые могут легко вырезаться из хромосомы после интеграции с использованием различных систем сайт-специфической рекомбинации: система Crdlox фага PI (Dale Е. С., Ow D. W, 1991); система Fp/FRT 2мкм дрожжевой плазмиды (Posfai G. et al, 1994; Cherepanov P. P., Wackernagel W., 1995); система mrs плазмиды RP4 (Kristensen C. S. et al, 1995). Для осуществления сайт-специфической рекомбинации необходимо присутствие по крайней мере двух активных рекомбинационных сайтов и экспрессия в клетке-хозяине соответствующей рекомбиназы. Все вышеперечисленные системы сайт-