Мутанты вируса оспы коров с делециями генов ВВК-семейства

• Автор: Колосова, Ирина Валерьевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 131 с. : ил.

Оглавление

Список сокращений

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Структурная организация и функциональная роль Kelch-домена

1.2. Структурная организация, распространение и функции белков, содержащих ВТВ-домен

1.3. BACK-домен в BTB-Kelch-белках

1.4. Структурная организация и функции BTB-BACK-Kelch-белков

1.5. BTB-BACK-Kelch-белки ортопоксвирусов

2. Материалы и методы

2.1. Материалы
2.2. Получение компетентных клеток Е. coli
2.3. Трансформация компетентных клеток Е. coli
2.4. Выделение и анализ плазмидной ДНК
2.5. Трансфекция клеток млекопитающих плазмидной ДНК
2.6. Титрование вируса и клонирование методом бляшек
2.7. Выделение вирусной ДНК в препаративном варианте
2.8. Культивирование вируса на ХАО КЭ
2.9. Анализ морфологии и размеров вирусных бляшек в культуре клеток CV-
2.10. Заражение животных
2.11. Компьютерный анализ данных
3. Результаты и обсуждение
3.1. Сравнительный компьютерный анализ генов, кодирующих ВВК-белки, в геномах поксвирусов
3.2. Получение клонового варианта ВОК
3.3. Конструирование плазмид интеграции для направленной делеции ВВК-генов
3.4. Получение мутантов ВОК с направленно делетированными генами, кодирующими ВВК-белки
3.5. Изучение биологических свойств мутантных вариантов ВОК
3.5.1. Репродукция различных делеционных мутантов ВОК в первичной (ФЭК) и перевиваемой (CV-1) культурах клеток
3.5.2. Динамика роста мутантов ВОК в культуре клеток CV-
3.5.3. Сравнение цитопатического эффекта ВОК и его делеционных мутантов в культуре клеток CV-
3.5.4. Рост мутантов ВОК при повышенной температуре
3.5.5. Сравнительная оценка чувствительности различных культур клеток к делеционным мутантам ВОК
3.5.6. Сравнительное изучение оспин, формируемых на ХАО КЭ делеционными мутантами ВОК
3.5.7. Электронно-микроскопическое исследование оспин
3.5.8. Эксперименты на лабораторных мышах

3.5.8.1. Определение Ы35о
3.5.8.2.0пределение динамики изменения среднего веса мышей,
инфицированных мутантами ВОК, с делециями ВВК-геноъ
3.5.9. Связь ВВК-белков ВОК с актиновым цитоскелетом клетки и их участие в формировании цитоплазматических выростов
4. Заключение
5. Выводы
6. Список литературы
Список сокращений
а.к. - аминокислота (аминокислотный остаток)
БОЕ - бляшкообразующая единица
ВОК - вирус оспы коров
ВОВ - вирус осповакцины
ВНО - вирус натуральной оспы
ВОО - вирус оспы обезьян
ВООв — вирус оспы овец
ВФК - вирус фибромы (оспы) кроликов
ВЭ (ВОМ) - вирус эктромелии (вирус оспы мышей)
КЭ - куриные эмбрионы
МРА - микофеноловая кислота
ООЕ - оспинообразующая единица
ОРТ — открытая рамка трансляции
п.н. - пар нуклеотидов
ПЦР - полимеразная цепная реакция
т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов
ФСБ - фосфатно-солевой буфер
ХАО - хорионаллантоисные оболочки
ЦПД - цитоплазматическое действие
ВВК-белки (гены) - BTB/BACK/Kelch-белки (гены)
dNTP - дезоксирибонуклеотидтрифосфаты

Так, в 80-х годах прошлого века активно проводились работы по картированию концевых районов генома вируса фибромы Шоупа, относящегося к роду Leporipoxvirus семейства Poxviridae, когда были выявлены повторяющиеся гены с взаимной гомологией и функциональной равнозначностью, обозначенные Тб, Т8, T9-L и T9-R (Upton and McFadden, 1986; Upton et al., 1990), отнесенные позже к генам, кодирующим ВВК-белки. Было показано, что при удалении достаточно большого фрагмента генома (8 кб), содержащего в том числе и гены Тб, Т8, T9-L, уменьшается туморогенность (способность индуцировать опухоли) вируса (Upton and McFadden, 1986).
Исследования, проводимые в настоящее время, осуществляются обычно путем нарушения генов, кодирующих ВВК-белки, после чего анализируют свойства полученных мутантов по сравнению с исходным «диким» типом (Pires de Miranda et al., 2003; Beard et al., 2006; Froggatt et al., 2007; Balinsky et al., 2007; Wilton et al., 2008).
Таким образом мутант ВООв (SPPV) с делецией SPPV-019 гена, кодирующего ВВК-белок, был получен из патогенного штамма SPPV-SA (Balinsky et al., 2007). Изучение влияния белка SPPV-019 на вирулентность вируса при интраназальном или интрадермальном введении показало, что исключение этого гена из генома ВООв приводит к заметной аттенуации вируса в природном хозяине. Однако, никаких очевидных различий в морфологии бляшек, формируемых в инфицированных культурах «диким» ВООв и вирусом с делецией гена SPPV-019 не было выявлено (Balinsky et al., 2007).
Исследования, проведенные на ВОВ с C2L или A55R ВВК делетированными генами (Pires de Miranda et al., 2003; Beard et al., 2006), no сравнению с родительским вирусом, после инокуляции мышей интраназально, не показали никакой разницы в потере веса или смертности зараженных животных. Проведенные модельные эксперименты на мышах показали, что нарушение одного гена ВВК в ВОВ не приводило к изменению вирусной вирулентности. Однако, при интрадермальном заражении мышей, делеция 5Ж-генов C2L, F3L, или A55R ВОВ изменяла патогенез этих вирусов (Pires de