CREA - зависимая углеродная катаболитная репрессия в Penicillium canescens

• Автор: Чулкин, Андрей Михайлович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 118 с. : ил.

Оглавление
Введение
Список сокращений, использованных в работе
1. Обзор литературы
1.1. Углеродная катаболитная репрессия в S. cerevisiae
1.1.1. Miglp и Mig2p
1.1.2. Киназный комплекс SNF1
1.1.3. Каталитическая субъединица Snflp
1.1.4. Бета - субъединицы
1.1.5. Субъединица Snf4p
1.1.7. Snflp-активирующие киназы Saklp, Elmlp, and Tos3p
1.1.8. Белковая фосфатаза Reglp-Glc7p
1.1.9. Hxk2p
1.1.10. Ssn6p(Cyc8p)-Tuplp
1.1.11. Механизм углеродной катаболитной репрессии в S. cerevisiae
1.2. Углеродная катаболитная репрессия в A; nidulans
1.2.1. С re А
1.2.2. А1с — система
1.2.3. СгеВ и СгеС
1.2.4. CreD и HulA

1.3. Углеродная катаболитная репрессия в других мицелиальных грибах
2. Материалы и методы
2.1. Реактивьц плазмидные вектора, ферменты
2.2. Бактериальные и грибные штаммы
2.3. Среды
2.4i Культивирование
2.5. Буферные растворы
2.6. Общие методы
. 3.
2.7. Измерение активностей ферментов
2.8; Качественный анализ экспрессии белков эндо-1-4-бета-ксиланазы
и бета-галактозидазы на чашках Петри
2.9. Мутагенез спор гриба Р: сапезсет
2.10; Трансформация гриба Р: сапеясепз
2.1Г.Злектрофоретическое разделение белков
2.12. Выделение высокомолекулярной:ДЕПЕС.из грибного мицелия;
2113; Выделение ДНК из грибного мицелия
2.14; Выделение РНК из грибного мицелия
2.15. Получение а-Р32-меченых фрагментов ДНК
2116. Гибридизация;
2.17. Скрининг фаговой библиотеки генов и анализ ДНК
рекомбинантныхфагов
2.18; Приготовление образцов ДНК для ЕМвА
2;19;ЕМ8Ач
2.20. Образная транскрипции РНК и ПЦР-РВ
2;21. Плазмидная трансформация клеток 2?
21221 ЭкспрессиягенаюгеЛЯ1?.1 сяиехселх в?клетках'£;соЛ7
2:23; Жидкостная? хроматография, белков
2.24: Компьютерные программы для анализа нуклеотидных,
последовательностей ДНК
2.25. Определение нуклеотиднойшоследовательности ДНК
2;26. Клонирование гена;сгеА Р. сапеъсет
2.27. Клонирование гена§рЛА Р. сапеьсет
2.28; Конструирование плазмид рЕТСгеА и рЕТпЕСгеА
2.29; Конструирование плазмидыфХНРН
2;30. Конструирование плазмиды,р6РВ::сгеА::СЕР
2.31. Использованные в работе синтетические олигонуклеотиды»
3; Результаты и;их обсуждение
3.1. Клонирование гена сгеА Р. сапезсепз

3:2: Структура гена сгеАР. сапеБсет
3.3. Клонирование гена р/Л-глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназы
Р. сапеэсепя
3.4. Структура гена §рс1А Р. сапеьсет
3.5. Анализ транскрипции сгеА Р. сапеясет при росте на различных источниках углерода методом ПЦР-РВ
1 3.6. Анализ локализации СгеА в клетках Р. сапеъсепъ
3.7. Определение сайтов связывания СгеАР. сапеясепя с промоторами
генов сгеА,ху1А и.bgaS
, 3.7.1*. Экспрессия гена сгеА Р. сапезсепя в клетках Е.соИ
, 3;7.2. Анализ взаимодействия промоторов генов ху1А, Ьда8 и сгеА Р.
I сапеБсеп8 с белком- СгеА Р: сапеясет методом ЕМ8А
3.8: Получение мутантов но-углеродной катаболитной репрессии Р.
сапезсепъ
3.9: Анализ.продукции эндо-1-4-бета-ксиланазы Ху1А в.мутантных по-
углеродной катаболитной репрессии, штаммах
3.10: Анализ мутации в, штаммах
3.11. Анализ транскрипции генов ху1АтсгеАъ,мутАпных штаммах

< 3:12: Получение мутантов по арабинозной активации в мутантах по
углеродной катаболитной репрессии Р. сяиехсенх
« 3.13. Анализ промоторной специфичности, выделенных мутантов на
модели промоторов ду/4*и
Выводы
Список литературы

одновременно с внешним индуктором. Как показано ранее, экспрессия alcA зависит от присутствия белка- активатора AlcR. Исходя из этого, репрессия alcR могла бы объяснить репрессию ale А. С другой стороны, в ale А промоторе обнаружены семь предполагаемых сайтов связывания СгеА (5 '-SYGGRG-3').
В штамме jgpdA::alcR, в котором alcR экспрессировался под сильным конститутивным промотором gpdA A. nidulans, транскрипция ale А существенно (на 50 %) дерепрессирована в присутствии глюкозы в среде. Поэтому, остальные 50 % дерепрессии, должны были быть обусловлены непосредственно'репрессией ale А промотора СгеА. Показано, что среди семи сайтов связывания СгеА с промотором ale А, два сайта в значительной степени ответственны за репрессию ale А. Мутационные исследования показали, что эти два сайта действуют парой, и удаление любого из-них приводит к почти полной дерепрессии ADHI. Разрушение двух сайтов сразу приводило полной дерепрессии экспрессии ale А. Эти результаты показывают, что СгеА - единственный репрессор, как и в случае alcR, действующий-непосредственно на alcA при углеродной катаболитной репрессии[130].
Эти два функциональных сайта связывания- СгеА расположены рядом, или даже перекрываются с сайтом связывания AlcR. Поэтому, можно ожидать, что как и в случае alcR- [63, 113], может существовать конкуренция между AlcR и СгеА за связывание с промоторной областью. И действительно,' разрушение одного1 или другого сайта приводили к увеличенному уровню индуцированной транскрипции alcA в дополнение к-полной дерепрессии на среде с глюкозой [130].
1.2.3: СгеВ и СгеС
Гены сгеВ и сгеС, также как сгеА, были идентифицированы как супрессоры агеА217 на среде, содержащей глюкозу и ацетамид. Мутантные аллели сгеВ и сгеС являются плеотропными и фенотипически неразличимыми друг от друга. Фенотипические явления не аддитивны в сгеВ' и в сгеС штаммах, что означает, что СгеВ и СгеС вероятно действуют в одной цепи или в комплексе [20, 81, 90, 105].
Ген сгеВ кодирует деубиквитинирующий белок СгеВ [105].