Рекомбинантные цитокины и цитокин-связывающие белки

• Автор: Гилева, Ирина Павловна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 312 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Цели и задачи исследования g

Научная новизна и практическая значимость результатов ^

исследования

Апробация работы

Структура и объем диссертации

Положения, выносимые на защиту ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

«РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКИ - ИММУНОМОДУЛЯТОРЫ»

1 ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ В КЛЕТКАХ Escherichia coli
2 ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ В КЛЕТКАХ
НАСЕКОМЫХ

3 ВЫДЕЛЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ ИЗ КЛЕТОК БАКТЕРИЙ И НАСЕКОМЫХ
4 РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКИ И ФАРМАЦЕВТИКА
4.1 ИНТЕРФЕРОНЕ! АЛЬФА
4.2 ФАКТОРЫ РОСТА КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА«
4.3 ВИРУСНЫЕ БЕЛКИ КАК ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ 116 СРЕДСТВА
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 13
1 МАТЕРИАЛЫ
2 МЕТОДЫ
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1 ЭКСПРЕССИЯ В E. COLI СИНТЕТИЧЕСКИХ И
ПРИРОДНЫХ ГЕНОВ
1.1 Конструирование рекомбинантных плазмид для экспрессии в клетках E.coli природных и синтетических
генов в составе искусственных полицистронных оперонов
1.2 Эффективность экспрессии генов в составе искусственных полицистронных оперонов
1.3 Экспрессия дуплицированного гена ifno.~2b в составе полицистронных оперонов с различным транскрипционным контролем

1.4 Выделение продукта экспрессии искусственного гена ifrio.-2b из клеток E. coli и анализ его структуры
1.5 Конструирование штамма E.coli — продуцента рекомбинантного интерферона сс-2Ь человека
1.6 Экспрессия гена гранулоцитарно-макрофагалъного колониестимулирующего фактора человека в клетках E.coli
1.7 Выделение продукта экспрессии синтетического гена gm-csf человека
1.8 Изучение биологических свойств рекомбинантного GM-CSF человека
1.9 Экспрессия полусинтетического гена tnf мыши
1.10 Обсуждение результатов
2 ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ПОКСВИРУСНЫХ TNF-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ В КЛЕТКАХ НАСЕКОМЫХ И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ
2.1 Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей TNF-связывающих белков вирусов натуральной оспы, оспы коров и оспы обезьян
2.2 Конструирование рекомбинантных бакуловирусов, продуцирующих CrmB-белки VARY, CPXVи MPXV
2.3 Выделение рекомбинантных ортопоксвирусных TNF-связывающих белков
2.4 Изучение физико-химических свойств ортопоксвирусных TNF-связывющих белков
2.5 Изучение биологических свойств ортопоксвирусных TNF-связывающих белков in vitro
2.6 Изучение биологических свойств ортопоксвирусных TNF-связывающих белков in vivo
2.7 Обсуждение результатов ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
а.о. — аминокислотный остаток
АТФ - аденозинтрифосфат
АТС — атомно-силовая микроскопия
БАВ - биологически активные вещества
БОЕ - бляшкообразующая единица
БОЕ-Э - бурстобразующая единица эритроцитов
ВГЖХ - высокоэффективная газожидкостная хроматография
ВЯП - вирус ядерного полиэдроза
ДНК (ss, ds, к) — дезоксирибонуклеиновая кислота (одноцепочечная или двуцепочечная, комплементарная)
ДТТ - дитиотриэтол
ИФН (IFN) - интерферон (interferon)
ИПТГ — изопропил-бета-О-тиогалактопиранозид
КД - круговой дихроизм
ККМ - клетки костного мозга
КОЕ-ГМ, КОЭ-Э - колониеобразующие единицы гранулоцитов и макрофагов, эритроцитов
ЛС - лекарственное средство
ЛПС, LPS — липополисахариды
ОП — оптическая плотность
ПААТ - полиакриамидный гель
ПСА - персульфат аммония
РИА - радиоиммуноанализ
мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота
СКВ — системная красная волчанка
fmer-TPHK _ формилметионин-транспортная рибонуклеиновая кислота
УФ — ультрафиолетовое облучение
т. п. о. - тысяч пар оснований
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭГТА - этиленгликоль-бис[|Заминоэтилэстер]-М,М,М,,'Ы’-тетрауксусная кислота ЭМ — электронная микроскопия Ар - ampicillin (ампициллин)
L.M. et al., 1984; Weyens G. et al., 1988; de Smith M.H., van Duin J., 1990). Последнее утверждение получило экспериментальное подтверждение в работе (Olsthoom R.C.L. et al., 1995), в которой показано, что у бактерифага MS2 удлинение или укорочение SD-последовательности вызывает компенсаторные изменения вторичной структуры РНК в районе RBS. В работе (Кравченко В.В. и др., 1988а) показана возможность инициации матриц, не содержащих SD-последовательностей.
Спейсер SD-AUG Как показывает анализ 5’-концевых последовательностей природных мРНК, расстояние между последовательностью SD и инициирующим кодоном варьирует от трех до десяти нуклеотидов. С помощью модельных экспериментов делались .попытки оценить вклад длины спейсера SD-AUG, а также его нуклеотидного состава в эффективность инициации трансляции. Результаты такого рода работ свидетельствуют, что, несомненно, имеет место влияние величины спейсера на уровень экспрессии маркерных генов (Kozak М., 2005).
5’-область генов Аденин- и аденин/урацил-богатые последовательности в 5’-области бактериальных генов облегчают инициацию трансляцию из-за более лабильных вторичных структур, формируемых мРНК (De Boer Y.A. et al., 1981; Chen H. et al., 1994; Qing G. et al., 2003). Количественный анализ взаимосвязи стабильности локальных вторичных структур RBS и уровня экспрессии гена белка оболочки фага MS2 in vivo (de Smith M.H., van Duin J., 1990) выявил, что рибосома не способна связываться с RBS, если его последовательность вовлечена в стабильную вторичную структуру (шпильку) с энергией образования шпильки AG°f = -7.8 - -14.1.
Также показано, что вклад в эффективную инициацию трансляции вносят такие структурные элементы мРНК как пиримидиновый тракт, обеспечивающий взаимодействие с рибосомальным белком S1 (Boni I.V. et al., 1991; Sengupta J. et al., 2001), и энхансерные элементы, расположенные