Изучение взаимодействия микротрубочек с белками кинетохорного комплекса

• Автор: Зайцев, Анатолий Владимирович
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 118 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
1 ВВЕДЕНИЕ

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2 1 Общие сведения о митозе

211 Фазы митоза и строение митотического аппарата

2 1 2 Микротрубочки

2 13 Общие сведения о кинетохоре

2 2 Динамика закреплений микротрубочка-кинетохор

2 3 Теоретические подходы к моделированию закрепления микротрубочки и кинетохора

2 4 Фосфорилирование кинетохорных белков киназой Aurora В играет ключевую роль в установлении биориентации хромосом

2 5 Комплекс NDC80 - важнейший кинетохорный компонент, связывающий микротрубочки

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3 1 Приготовление проточной камеры, очистка и силанизация покровных стекол
3 1 1 Изготовление многоразовых проточных камер
3 12 Подготовка покровных стекол
3 2 Приготовление микротрубочек, стабилизированных таксолом и белков NDC80
3 3 Микроскопия полного внутреннего отражения
3 4 Анализ данных микроскопии
3 4 1 Определение кривых связывания комплексов NDC80 и МТ с помощью TIRF
микроскопии
3 4 2 Анализ кооперативное NDC80-MT взаимодействия с использованием метода восстановления флюоресценции после выжигания (FRAP)
3 5 Теоретические подходы к оценке энергии связывания с МТ
4 РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1 Описание математической модели сайта связывания микротрубочки с кинетохора
4.2 Математическая модель сайта связывания микротрубочки
4.2.1 Фракция МТ-связанных комплексов определяет время закрепления МТ к
сайту.
4.2.2 Физиологическая стабильность закрепления МТ за кинетохор обеспечивается крайне короткоживущими взаимодействиями между комплексами и МТ
4.2.3 Коопсративность молекулярных взаимодействий сильно увеличивает
влияние молекулярных параметров на стабильность закрепления КМТ
4.3 Характеризация взаимодействия комплекса NDC80 и микротрубочек in vitro
4.3.1 Взаимодействие NDC80 и МТ определяет полное число фосфомиметических замен, а не их положение в хвосте Heel
4.3.2 Увеличение числа фосфомиметических мутаций в хвосте Heel приводит к
градуальному росту коэффициента диффузии комплекса NDC80 по МТ и уменьшению времени взаимодействия с МТ
4.3.3 Увеличение числа фосфомиметических замен в хвосте Heel градуально уменьшает энергию взаимодействия между единичными молекулами NDC80 и МТ.
4.3.4 Взаимодействие NDC80-NDC80 слабое по сравнению с взаимодействие
NDC80-MT
4.3.5 Кооперативность NDC80-MT взаимодействия не изменяется при
фосфорилировании хвоста Heel
4.4 Экспериментальное и теоретическое исследование зависимости числа микротрубочек на кинетохоре от фосфорилирования комплекса NDC
4.4.1 Клетки с мутантным комплексом NDC80, содержащим одну
фосфомиметическая мутацию в хвосте Heel комплекса NDC80, имеют нормальный кинетохорный пучок
4.4.2 Модель полного кинетохора со множеством сайтов закрепления
4.4.3 Алгоритм симуляции
4.4.4 Анализ чувствительности сайтовой модели кинетохора

4 5 Модель кинетохсра, содержащая сайты связывания КМТ не может описать наблюдаемые изменения в регуляции кинетохор-МТ взаимодействия при фосфорилировании
4 6 Математическая модель, в которой взаимодействие комплексов NDC80 с МТ не ограничено сайтами, дает хорошее описание экспериментальных данных
5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ
6 ВЫВОДЫ
7 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
8 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

буфера BRD80, содержащего 10 мкМ таксола (Sigma) (рис 3.3). В промытую камеру вмывапся раствор микротрубочек в BRB80 буфере с 10 мкМ таксола и инкубировался 15 мин. NDC80 комплекс разводился до концентрации 50 пМ в экспериментальном буфере (K-Pipes 80 мМ, pH 6.9 , 4 мМ Mg, 1 мМ EGTA, 0.5 мг/мл казеин, 4 мг/мп BSA, 2 мМ DTT,
0.1 мг/мл глюкозо оксидаза, 68 мкг/мл каталаза, 20 мМ глюкоза, 0.5% 2-меркаптоэтанол, 10 мкМ таксол) и вмывапся в камеру. Проток раствора с NDC80 комплексом поддерживался постоянно в течение эксперимента для поддержания постоянной концентрации белка в микроскопной камере.
3.4 Анализ данных микроскопии
Учет неоднородности освещенности поля. Алгоритм корректировки изображений на неоднородность лазерного освещения был разработан автором диссертации. Все микроскопные изображения перед обработкой нормировались на профиль лазера для учета неоднородности освещенности поля (рис 3.4).
I. Был подготовлен раствор белка GFP в концентрации 50 нМ в буфере BRB-80. Была подготовлена микроскопная камера, аналогичная описанной в пункте 3.1, в которую был вмыт раствор GFP.
II. Было собрано больше 50 изображений микроскопного поля: микроскопный стол с закрепленной микроскопной камерой перемещался в новую позицию, при этом затвор подсветки был закрыт; затем сразу после открытия затвора получались изображения, затвор закрывался, и стол вновь изменял позицию.
iii. Была построена средняя проекция полученного множества изображений и проведена фильтрация с использованием алгоритма Gaussian Blur с параметром радиуса в 5 пикселей. Для проведения этой операции использовался программный комплекс ImageJ и другие программные пакеты. Результирующее изображение представляет собой распределение интенсивности освещения микроскопного поля обзора lllum(x,y), где х и у соответствуют координатам в пиксельных единицах измерения. Была определена максимальная яркость пикселя на результирующем изображении Max(lllum).
iv. С закрытым затвором освещения, используя те же параметры экспозиции и усиления, было получено одно изображение и определена средняя интенсивность освещенности пикселей на нем - эта величина соответствует величине CN - шуму