Атомно-силовая микроскопия как инструмент определения чувствительности бактерий к факторам биотической и абиотической природы

• Автор: Ерохин, Павел Сергеевич
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 126 с. : ил.

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

АСМ - атомно-силовой микроскоп (или атомно-силовая микроскопия);

СЗМ - сканирующий зондовый микроскоп (или сканирующая зондовая микроскопия);

СТМ - сканирующий туннельный микроскоп (или сканирующая туннельная микроскопия);

СТС - сканирующая туннельная спектроскопия;

ССТ - сканирующая силовая микроскопия;

ТЭМ - трансмиссионный электронный микроскоп (или трансмиссионная электронная микроскопия);

СЭМ - сканирующий электронный микроскоп (или сканирующая электронная микроскопия);

ЭПС — экзополисахаридный матрикс.

ОГ .ДАВЛЕНИЕ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1. Современные возможности метода сканирующей зондовой микроскопии в микробиологии
2. Изучение ультраструктуры микроорганизмов методом атомносиловой микроскопии
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1. Штаммы микроорганизмов
2.2. Реактивы и буферные растворы
2.3. Оборудование для экспериментов
2.4. Подготовка микроорганизмов для исследования методом атомно-силовой микроскопии
2.5. Статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3. Адаптация параметров сканирования атомно-силовой микроскопии для изучения микроорганизмов и повышение качества полученных изображений
3.1. Разработка алгоритма определения оптимальных диапазонов основных параметров сканирования бактерий методом атомносиловой микроскопии
3.1.1. Изучение влияния амплитуды колебаний кантилевера на качество изображения
3.1.2. Выбор оптимальных значений фазы колебаний кантилевера при использовании методов отображения фазы и модуляции силы

3.1.3. Управление скоростью сканирования ACM
3.1.4. Оценка влияния взаимодействия зонда с поверхностью образца на качество изображения
3.1.5. Влияние коэффициента усиления цепи обратной связи
3.2. Разработка методики обработки ACM изображений биопрепаратов с использованием модуля Image
Analysis
ГЛАВА 4. Выбор методов подготовки микроорганизмов для
исследования методом атомно-силовой микроскопии
4.1. Влияние денатурирующих методов фиксации на морфологию и ультраструктуру бактериальной клетки
4.2. Влияние методов аддитивной фиксации на морфологию и ультраструктуру бактериальной клетки
Глава 5. Изучение морфо-функциональной реакции бактерий на ,
различные воздействия методами атомно-силовой микроскопии
5.1. Изучение биопленок микроорганизмов методом атомносиловой микроскопии
5.1.1. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам с помощью ACM
5.1.2. Исследования влияния кислотного и щелочного стресса
на микроорганизмы с помощью ACM
5.2. Комплексный подход к изучению биопленок микроорганизмов методом атомно-силовой микроскопии
5.3. Влияние поверхностных белковых структур микроорганизмов
на альтернативные подложки - мембраны из хитозана
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

напыленных золотом, для полуконтактной ACM (резонансная частота кантилевера составляла 120 кГц, константа жесткости - 5,5 Н/м) и CSG 10 (NT-MDT, Россия) для контактной ACM (резонансная частота кантилевера составляла 20 кГц, константа жесткости - 0,1 Н/м). Силы, приложенные к биологическим объектам, могут быть минимизированы выбором соответствующего диапазона указанных параметров сканирования, что способствует получению воспроизводимых, надежных данных об объекте исследования.
3.1.1. ИЗУЧЕНИЕ ВЛЯИНИЯ АМПЛИТУДЫ КОЛЕБАНИЙ КАНТИЛЕВЕРА НА КАЧЕСТВО ИЗОБРАЖЕНИЯ
Вкладка Resonance способствует поиску значений амплитуды колебаний кантилевера при его резонансной частоте. Адаптация амплитуды колебаний кантилевера проводилась в диапазоне от 10 до 50 единиц с шагом в 5 единиц на примере E.coli и S.aureus.
При значениях амплитуды колебаний зонда в диапазоне 10-20 единиц обратная связь в полной мере не обеспечивала качественную обработку полученных данных, в режиме прерывистого контакта. Это проявлялось в «смазывании» изображения. Линейные размеры (длина, ширина) бактерий в 1,5-2,5 раза превышали истинные значения микроорганизмов.
Установка значений параметра Amplitude в диапазоне 20-25 единиц в режиме прерывистого контакта позволила минимизировать шумы прибора при изучении микроорганизмов и получить воспроизводимые результаты значений линейных размеров бактерий.
Было установлено, что при увеличении амплитуды колебаний кантилевера от 25 до 50 единиц (уменьшении области притяжения), шумы аппаратуры монотонно возрастали, что проявлялось в появлении на изображениях артефактов механической природы (рисунок 1).