Конкурентный транспорт ионов в цитоплазматическом канале доступа Na+,K+-АТФазы

• Автор: Ташкин, Всеволод Юрьевич
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 98 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 .Выделение КаДК^АТФазы
1.2 .Цикл Альберса-Поста
1.3 .Неканонические режимы работы белка
1.4.Структура Ыа+.К+-АТФазы
1.5.Различие структуры Ка+.К'-АТФазы в двух основных конформациях
1 .б.Ингибиторы Ха .К+-А ГФазы
1.7.Сайты связывания ионов в белке
1.7.1.Гипотетическая последовательность связывания Иа+
1.8. Определение констант связывания К+ и Ка+ в цитоплазматических сайтах связывания Ха'.К'-АТФазы
1.9.Специфичность 1Уа+.К+-АТФазы к переносимым ионам
1.10.Влияние многовалентных ионов
1.11 .Электрогенность ХаДК+-АТФазы. Диэлектрические коэффициенты
1.12.Модель электрогенного транспорта ионов Ка+.К+-АТФазой
1.13 .Исследования на клетках. Нестационарный транспорт
1.14.Исследования на плоских бислойных мембранах. Метод адмиттанса
1.15.Влияние pH на активность Ха+.К' АТФазы
1.16 .Постановка задачи
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 .Материалы
2.2.Методы
2.2.1.Методы формирования БЛМ и регистрации токов Хга",К+-
АТФазы
2.2.2.Метод компенсации внутримембранного поля с помощью второй гармоники емкостного тока
3.РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1.Опыты с сааеб-АТР
3.2.0пыты с сааесЫЕ
3.2.1.Опыты на БЛМ без адсорбированных мембранных фрагментов
3.2.2.Опыты с Иа+,К+-АТФазой
3.2.2.1 .Определение констант связывания Ма' и К+ в
цитоплазматических сайтахИа+,К+-АТФазы
3.2.2.2.Зависимость связывания Ма+ в цитоплазматических сайтах от
концентрации Mg2+
3.3.Заключение
4.ВЫВОД Ы
5.СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
5-IAF - 5-(иодоацетамидо)флюоресцеин
Caged-ATP - аденозин-5’-трифосфат, РЗ-(1-(2-нитрофенил)-этил) эфир Caged-EE (МКР8)-2-метокси-5-нитрофенилсульфат, натриевая соль DPhPC - дифитаноилфосфатидилхолин
EPPS - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинпропансульфоновая кислота MES - 2-(ЕГ-морфолино)этансульфоновая кислота NMG - N-Мети л- D- гл ю кам ин PCP - пентахлорфенол
RH-421 - [М-(4-Сульфобутил1)-4-(4-(4-(дипентиламино)фснил) бутадиенил)
пиридиний]
SDS - додецилсульфат, натриевая соль TRTS - трис(гидроксиметил)аминометан АДФ - аденозиндифосфорная кислота АТФ - аденозинтрифосфорная кислота АЦП - аналого-цифровой преобразователь БЛМ - бислойная липидная мембрана ДК - диэлектрический коэффициент МФ - мембранный фрагмент УФ - ультрафиолетовый ЦАП - цифро-аналоговый преобразователь ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

В исходном нефосфорилированном состоянии белок находится в конформации Еь При этом открыт канал с внутриклеточной стороны мембраны, через который ионы натрия из раствора попадают внутрь белка и связываются в активном центре. После фосфорилирования белок переходит сначала в состояние окклюзии натрия, в котором ионы запираются внутри белка, затем в состояние Е2, в котором открывается канал с внеклеточной стороны, и ионы высвобождаются во внеклеточную среду (Wuddel and Apell, 1995; Heyse et al., 1994); Holmgren et al., 2000). Через этот канал три иона натрия выходят в раствор, и вместо них связываются два иона калия. После этого происходит дефосфорилирование и белок переходит в конформацию Ej через состояния окклюзии ионов калия и открытия канала с цитоплазматической стороны, в который эти ионы выходят, и цикл завершается.
Так как ДК перемещения первого иона составляет 0,7 (Wuddel and Apell, 1995; Holmgren et al., 2000), принято считать, что после состояния окклюзии натрия происходит сначала открытие узкого глубокого канала доступа между сайтами связывания внутри белка и водным раствором с внеклеточной стороны, через который проходит первый ион натрия (узкий канал объясняет высокий ДК стадии) (Lauger, 1991). Причины низкой электрогенности транспорта двух других ионов натрия и ионов калия остаются предметом дискуссий. Согласно одной из гипотез, это связано с тем, что канал с внеклеточной стороны первоначально открывается как узкий, и в нем перемещается первый ион натрия, но затем, для выхода двух оставшихся ионов, он расширяется. Однако, это не объясняет низкой электрогенности перемещения этих ионов, поскольку тогда электрогенным должно стать открытие либо закрытие самого канала (Павлов и Соколов, 1999). Согласно другой гипотезе, после выхода первого иона происходит конформационное изменение, которое перемещает участок с двумя ионами в сторону внеклеточного водного раствора, поскольку ДК стадий выхода оставшихся ионов составляет 0,1 - 0,2 (Wuddel and Apell, 1995; Holmgren et al., 2000). В последнее время была предложена модель, согласно которой низкая электрогенность транспорта этих ионов связана с тем, что вместо их перемещения