Роль ингибитора пути тканевого фактора в пространственном формировании фибринового сгустка

• Автор: Парунов, Леонид Александрович
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 122 с. : ил.

Оглавление
1 ВВЕДЕНИЕ

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Общие представления о гемостазе человека

2.1.1 Механизмы гемостаза (триада гемостаза)

2.1.2 Плазменное звено свертывания крови

2.1.2.1 Формирование фибринового сгустка

2.1.2.2 Каскад свертывания

2.1.2.3 Два пути активации каскада свертывания

2.1.2.4 Кофакторы и мембран зависимые реакции

2.1.2.5 Ингибирование свертывания
2.2 Внешний путь активации свертывания и его регуляция
2.2.1 Компоненты внешнего пути свертывания
2.2.1.1 ТФ - активатор внешнего пути свертывания
2.2.1.2 Фактор VII
2.2.1.3 TFPI - ингибитор внешнего пути свертывания
2.2.1.3.1 Структура и изоформы TFPI
2.2.1.3.2 Распределение TFPI в системе кровообращения
2.2.1.3.3 TFPI в плазме
2.2.1.3.4 TFPI в тромбоцитах
2.2.2 Регуляция внешнего пути свертывания
2.2.2.1 Механизмы активации свертывания
2.2.2.2 Ингибирование фактора Ха посредством TFPI
2.2.2.3 Ингибирование комплекса У11а:ТФ посредством TFPI
2.2.2.4 Представления о роли TFPI в гемостазе в организме
2.2.2.5 Роль TFPI в заболеваниях
2.3 Нарушения плазменного гемостаза при гемофилии
2.3.1 Общие сведения о гемофилиях А и Б
2.3.2 Терапия гемофилии Au Б
2.3.2.1 Заместительная терапия
2.3.2.2 Другие способы лечения гемофилий
2.3.2.3 Идея генной терапии гемофилии
2.3.2.4 Идея ингибирования TFPI
2.4 Влияние ингибиторов TFPI на свертывание. Последние данные
2.4.1 Данные исследований с использованием аптамера ВАХ
2.4.1.1 Фармакокинетические исследования с ВАХ499 и специфичность аптамера
2.4.1.2 Влияние ВАХ499 в тесте генерации тромбина (ТГТ)
2.4.1.3 Влияние ВАХ499 на показания тромбоэластографии (ТЭГ) и тромбоэластометрии (ТЕМ)
2.4.1.4 Изменчивость реакции на ВАХ
2.4.1.5 Результаты клинических испытаний ВАХ
2.4.2 Влияние других ингибиторов TFPI на свертывание

2.5 Экспериментальные модели свертывания крови
2.5.1 Модели свертывания in vivo, ex vivo и in vitro
2.5.2 Принципиальные подходы к регистрации свертывания
2.5.3 Пространственно-однородные модели
2.5.4 Пространственно-неоднородные модели
2.5.5 Типы математических моделей. Достоинство и недостатки
2.5.6 Феноменологические модели
2.5.7 Количественные детальные модели
3 МАТЕРИАЛ Ы И М ЕТОДЫ
3.1 Приобретенные материалы
3.2 Приготовление активаторов свертывания
3.2.1 Иммобилизация тромбопластина на полистироловую поверхность
3.2.2 Определение плотности иммобилизованного тканевого фактора
3.3 Подготовка образцов плазмы крови
3.3.1 Протокол приготовления свежей плазмы крови
3.3.2 Протокол приготовления лиофилизированной плазмы с дефицитом TFPI
3.3.3 Протокол приготовления замороженной плазмы больных гемофилией А
3.3.4 Стабилизация pH плазмы
3.3.5 Ингибирование контактной активации
3.3.6 Подбор пациентов для исследования взаимодействия лекарственных препаратов
3.3.7 Протокол исследования взаимодействия лекарственных препаратов
3.4 Методы исследования свертывания плазмы крови
3.4.1 Стандартные тесты: АЧТВ и определение уровня фактора VIII
3.4.2 Рост сгустка в пространстве (Тромбодинамика)
3.5 Схема и устройство прибора Тромбоимаджер
3.5.1 Конструкция кюветы
3.5.2 Схема и принцип работы прибора Тромбоимаджер
3.5.3 Получение изображений
3.5.4 Обработка экспериментальных кадров
3.6 Статистическая обработка результатов
3.7 Математическая модель свертывания
4 РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1 Планирование эксперимента
4.1.1 Выбор реактивов
4.1.2 Описание параметров, характеризующих пространственный роста сгустка
4.1.3 Предварительная оценка влияния TFPI: компьютерное моделирование
4.2 Ингибирование TFPI в плазме здоровых доноров: эксперименты in vitro
4.2.1 Влияние плотности ТФ на эффект от ингибирования TFPI

4.3 Влияние ВАХ499 на свертывание в плазме с дефицитом ТГР
4.3.1 Ингибирование ТРР1 в плазме здоровых доноров
4.3.1.1 Дозозависимости при активации низкой плотностью тканевого фактора
4.3.1.2 Эффект ВАХ4Э9 при активации средней плотностью тканевого фактора
4.4 Изучение эффектов от ингибирования ТГР1 в плазме больных гемофилией А
4.4.1 Характеристика исследуемых больных гемофилией А
4.4.2 Ингибирование ТРР1 в плазме больных гемофилией А
4.4.2.1 Статистическое сравнение эффективности ВАХ499 и Моуоэеуеп в ускорении
свертывания плазмы больных гемофилией А
4.5 Совместное влияние ТЯР! и фЛП на пространственное свертывание плазмы крови
4.5.1 Исследование взаимодействия ВАХ499 и концентратов фактора VIII
(компьютерное моделирование)
4.5.2 Исследование взаимодействия ВАХ499 и концентратов фактора VIII
(эксперимент)
4.6 ИнгибированиеТГР! в плазме сдефицитом ф1Х (компьютерное моделирование)
5 ОБСУЖДЕНИЕ
5.1 Границы действия ТТР
5.2 Снижение плотности фибринового сгустка из-за ТРР
5.3 Порог по активации и ТБР
5.4 Эффективность ингибирования ТБР1 в гемофилии и норме
5.5 Фактор VIII и ингибитор ТБР!. Совместное действие и его механизм
5.6 Клиническое значение
5.7 Исключение. Второй тип больных гемофилией А
5.8 Другие формы гемофилии и ингибиторы ТБР
5.9 Сравнение эффектов от я/11а и ингибирования ТБР!
5.10 Недостатки экспериментальной модели
5.11 Экспериментальные ошибки
5.12 Согласие эффективных концентраций ВАХ499 с другими работами
5.13 Специфичность ВАХ
5.14 ВАХ499 КАК ЛЕКАРСТВО И ИНСТРУМЕНТ ИССЛЕДОВАНИЯ РОЛИ ТБР
6 ВЫВОДЫ
7 БЛАГОДАРНОСТИ
8 ПРИЛОЖЕНИЯ
8.1 Контрольные эксперименты
9 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
10 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

i_ IS

■ базовый уровень □ 0,03 мг/кг В 0.1 мг/icr О 0,5 мг/кг ЕЭ 1 мг/кг Q 1.5 мг/кг
Рис. 6. Подкожное введение AV513 улучшает динамику свертывания у собак больных гемофилией А. В исследовании с увеличением дозы AV513 плазма, взятая в начале и конце каждого периода, изменения дозировки использовалась для оценки ТЭГ. Время К представляет время, требуемое для образования сгустка 2 мм. (а) Прогрессивные изменения во времени ТЭГ (R) для отдельных животных в течение терапии, (б) Усредненное для каждой дозы время ТЭГ у трех собак. Ошибки показывают стандартное отклонение (*Р=0,017, **Р=0,019 по сравнению с базовым значением), (в) Угол ТЭГ представляет скорость образования фибрина, Р значения для доз 0,5 ; 1,0 ; и 1,5 мг/кг составляет 0,04; 0,002; 0,001, соответственно. Собаки: Gloria(a), Morag(A), Angus (♦). Прямоугольные области показывают область нормальных значений, (г) Амплитуда ТЭГ. Иллюстрация заимствована из 1194].
Искусственно синтезированные ингибиторы TFPI обладают огромным преимуществом перед различными рекомбинантными факторами свертывания, так как время их полувыведения может легко быть увеличено за счет пришивания полиэтиленгликоля (ПЭГ) к активной молекуле, что позволяет увеличить время полувыведения и интервалы между инфузиями этих препаратов [195]. Пример влияния длины ПЭГ на изменение концентрации одного из ингибиторов TFPI (JBT1857) в крови животных показан на Рис. 7.
Таким образом, TFPI стали рассматривать как мишень для прокоагулянтной терапии. Данные этих исследований привели к разработке целого ряда новых ингибиторов TFPI, которые могли бы быть полезны при терапии и профилактики кровотечений. Одним из них является аптамер ВАХ499 (ранее ARC19499), используемый в данной работе.