Исследование процессов адресной доставки генетического материала в раковые клетки и в опухоли меланомы

• Автор: Дурыманов, Михаил Олегович
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 99 с. : ил.

Оглавление

Список сокращений

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Системы доставки НК, их преимущества и недостатки

2.2. Обзор используемых полимеров для доставки генов

2.3. Препятствия на пути полиплексов в организме и возможные подходы для увеличения эффективности доставки НК

2.4. Обзор генов, используемых для терапии рака

2.4.1. Терапия с помощью генов суицида

2.4.2. Корректирующая генная терапия

2.4.3. Иммуномодуляторная генная терапия

2.4.4. Использование транспортирующих молекул в генной терапии и диагностике рака
3. Материалы и методы
3.1. Блок-сополимеры для приготовления полиплексов
3.2. Плазмиды
3.3. Приготовление полиплексов
3.4. Измерение размеров и ^-потенциалов полиплексов
3.5. Получение изображений полиплексов на слюде с помощью атомно-силовой микроскопии
3.6. Флуоресцентное мечение компонентов полиплексов
3.7. Культивирование клеток
3.8. Определение цитотоксичности полиплексов и ингибиторов эндоцитоза
3.9. Доставка гена ЕОРР с помощью полиплексов в клетки и определение доли трансфицированных клеток
3.10. Доставка гена люциферазы с помощью полиплексов в клетки и определение уровня её экспрессии
3.11. Доставка гена НИС с помощью полиплексов в клетки и определение уровня его экспрессии по поглощению радиоизотопа 1
3.12. Обработка клеток ингибиторами эндоцитоза
3.13. Измерение эффективности поглощения полиплексов раковыми клетками в культуре
3.14. Съемка изображений клеток на конфокальном микроскопе при добавлении полиплексов с флуоресцентно меченными ДНК и блок-сополимером
3.15. Внутриклеточная локализация и распаковка полиплексов
3.16. Постановка накожных камер мышам для прижизненной микроскопии и инокуляция опухолевых клеток под камеры
3.17. Прижизненная микроскопии и количественная оценка кинетики накопления и микрораспределения полиплексов в опухоли и в нормальной подкожной соединительной ткани
3.18. Выявление взаимного расположения сосудов и раковых клеток в опухоли с помощью прижизненной микроскопии
3.19. Выявление распределения изотопа Ш1 и его накопления в опухолях с помощью однофотонной эмиссионной компьютерной томографии
4. Результаты
4.1. Физико-химические характеристики полиплексов
4.2. Цитотоксичность полиплексов
4.3. Эффективность поглощения и доставки генов с помощью полиплексов
4.4. Ингибиторный анализ путей эндоцитоза полиплексов
4.5. Изучение кинетики внутриклеточного транспорта и распаковки полиплексов

4.6. Изучение кинетики накопления полиплексов в опухоли и в нормальной подкожной соединительной ткани
4.7. Детальный анализ микрораспределения полиплексов
4.8. Модельное описание микрораспределения полиплексов
4.9. Влияние наличия лиганда на микрораспределение полиплексов в опухоли
5. Обсуждение
6. Заключение
7. Выводы
Благодарности
Список литературы

Список сокращений
ACM - атомно-силовая микроскопия ДС - динамическое светорассеяние
KJ1CM - конфокальная лазерная сканирующая микроскопия
КТ - рентгеновская компьютерная томография
HAT - нарадреналиновый транспортёр
НИС - натрий-йод симпортёр
НК - нуклеиновые кислоты
н.п. - нуклеотидные пары
ОФЭКТ - однофотонная эмиссионная компьютерная томография ПАМАМ - полиамидоамин ПЛ - поли-Ь-лизин
ПСД - поли(метакрилоил сульфодиметоксина)
ПЭГ - полиэтиленгликоль
ПЭИ - полиэтиленимин
ФС - фотосенсибилизатор
ЯПК - ядерный поровый комплекс
аМСГ - а-меланоцит-стимулирующий гормон
CD - цитозиндезаминаза (cytosine deaminase)
CMV - цитомегаловирусный промотор
EPR - эффект “повышенной проницаемости и удерживания” (“enhanced permeability and retention”)
FRET - безызлучательный резонансный перенос энергии по Фёрстеру (Forster resonance energy transfer)
GCV - ганцикловир (ganciclovir)
GFP - зелёный флуоресцирующий белок (green fluorescent protein)
HRP - пероксидаза хрена (horseradish peroxidase)
HSVrA: - тимидинкиназа вируса простого герпеса (Heres simplex virus thymidine kinase)
IAA - индолил-уксусная кислота (indolyl acetic acid)
MC1R - меланокортиновые рецепторы 1 типа (melanocortin receptors-1)
MC1SP - пептид, имеющий в своем составе последовательность, связывающуюся с меланокортиновыми рецепторами первого типа, и минимальную последовательность ядерной локализации большого Т-антигена вируса SV-
NFkB - транскрипционный фактор (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated В cells)

ДНК в растворе полиплексов, предназначенных для трансфекций клеток in vitro, составляла 20 мкг/мл, для введения мышам - 200 мкг/мл.
Все работы по приготовлению полиплексов проводились в ламинарном шкафу в стерильных условиях.
3.4. Измерение размеров и ^-потенциалов полиплексов
Измерения размеров и ^-потенциалов полиплексов проводили методом динамического светорассеяния на приборе ZetaPALS (Brookhaven Instruments, США) в тех же растворах, в которых они были приготовлены. Размеры полиплексов измеряли в 40 мкл кварцевой кювете при 25 °С, детектируя сигнал рассеянного света под углом 90° в течение 1 часа. Средний гидродинамический диаметр частиц был определен для преобладающей фракции полиплексов (99,9 % от общего числа частиц в суспензии).
^-потенциалы полиплексов были измерены в 4 мл кювете с помощью стандартной электрофоретической ячейки прибора ZetaPALS при 25 °С в течение 1 часа. Для расчета величины ^-потенциала были выбраны следующие параметры: вязкость - 1,078 сП, индекс преломления среды - 1,338, диэлектрическая постоянная - 78,54.
3.5. Получение изображений полиплексов на слюде с помощью атомносиловой микроскопии
Изображения полиплексов с лигандом были получены с помощью атомно-силового микроскопа Nanoscope Ilia Multimode (Veeco Instruments, США) в режиме прерывистого контакта в жидкой среде (2,5 % глюкоза в 20 мМ HEPES, pH 7,0). Были использованы V-образные кантилеверы “Nanoprobe” NP-S (oxygen shaped) из Si3N4 длиной 115 и 193 мкм с константами упругости 0,06 и 0,12 Н/м. Номинальный радиус кривизны острия используемых кантилеверов составляет 10 нм. Сила воздействия иглы на образец была минимизирована. Сканирование проводилось при комнатной температуре (20-23 °С) с частотой 2-3 Гц с разрешением 512 х 512 точек. Рабочая резонансная частота кантилевера составляла около 9 кГц.
3.6. Флуоресцентное мечение компонентов полиплексов
Для флуоресцентного мечения биотинилированной плазмидной ДНК (phTert-HSVtA) были использованы квантовые точки QD605, покрытые стрептавидином (Invitrogen, США). Реакция биотинилирования плазмиды проводилась с использованием набора для нерадиоактивного мечения ДНК «Биотин-Рэндомпрайм» (Силекс, Россия) согласно