Атомно-силовая микроскопия: от бактериальных клеток до нуклеиновых кислот и белков

• Автор: Мачулин, Андрей Валериевич
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 152 с. : ил.

Оглавление
Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. АСМ как метод исследования в биологии

1.1.1. Основные методы исследования биологических объектов и их структурных особенностей

1.1.2. Атомно-силовая микроскопия

1.1.2.1. Основы АСМ

1.1.2.1.1. Зондовые датчики

1.1.2.1.2. Оптическая система регистрации

1.1.2.1.3. Система точного позиционирования

1.1.2.1.4. Управляющая электроника

1.1.2.2. Режимы измерения в АСМ
1.1.2.2.1. Контактный режим АСМ
1.1.2.2.2. Полуконтактный режим АСМ
1.1.2.3. Микроскоп ИНТЕГРА Вита
1.2. АСМ бактериальных клеток, белковых молекул и молекул ДНК
1.2.1. Основные методики препарирования биологических образцов для АСМ
1.2.2. Применение АСМ для исследования бактериальных клеток
1.2.3. Возможности АСМ в исследованиях молекул нуклеиновых кислот, белков и их комплексов
1.2.3.1. Нуклеиновые кислоты
1.2.3.2. Белковые молекулы
1.2.3.3. Амиллоидные фибриллы
1.2.3.4. Комплексы белков и нуклеиновых кислот
1.3. Объекты исследования
1.3.1. Фототрофные пурпурные бактерии
1.3.1.1. Общая характеристика фототрофных пурпурных бактерий
1.3.1.2. Влияние грг-трансформации на клетки бактерий
1.3.1.3. Фотосинтетический аппарат фототрофных пурпурных
бактерий

1.3.2. Белок УВ
1.3.2.1. Амилоидогенные белки
1.3.2.2. Общая характеристика белка УВ
1.3.2.3. Фибриллы белка УВ
1.3.3. Сайт-специфическое связывание никующей эндонуклеазы №.Взр061 с ДНК
1.3.3.1. Никующая эндонуклеаза
1.3.3.2. Модель комплекса никазы №.В8рБ61 с ДНК
Глава 2. Теоретическая часть
2.1. Обработка и представление полученной информации
2.1.1. Обработка АСМ данных
2.1.2. Представление АСМ данных
2.1.3. Устранение общих искажений
2.1.3.1. Выравнивание поля
2.1.3.2. Усреднение по строкам
2.1.3.3. Фильтрация шумов
2.1.3.4. Восстановление поверхности с учетом формы иглы
2.1.4. Анализ АСМ-изображений
2.2. Калибровка атомно-силового микроскопа
2.2.1. Тестирование на различных объектах
2.2.2. Объем белковых молекул по АСМ-данным. Белок УВ
Глава 3. Материалы и методы
3.1. Фототрофные пурпурные бактерии
3.1.1. Объекты исследования
3.1.2. Среды для выращивания КЬос1аЪааег вркаегогёез
3.1.3. Модификация генома Шос1оЬас1ег 8ркаего1с1е8 методом конъюгации
3.1.3.1. Конъюгация на агаризованной среде
3.1.3.2. Конъюгация в жидкой среде
3.1.4. Идентификация гена биосинтеза цитокининов
3.1.4.1. Выделение ДНК
3.1.4.2. Полимеразная цепная реакция

3.1.5. Выделение и идентификация липополисахаридов
3.1.5.1. Определение хемотипа культуры
3.1.5.2. Получение беспигментной клеточной биомассы
3.1.5.3. Выделение липополисахаридов
3.1.6. Колориметрическое определение количественного содержания

3.1.7. Выделение О-специфического полисахарида
3.1.8. АСМ и ТЭМ
3.2. Белок YB
3.2.1. Получение белка YB-1 и условия образование фибрилл
3.2.2. Аналитическое ультрацентрифугирование
3.2.3. Атомно-силовая микроскопия
3.3. Сайт-специфическое связывание никующей эндонуклеазы Nt.BspD6I с

3.3.1. Выделение плазмидной ДНК из Escherichia coli
3.3.2. ПЦР-амплификация
3.3.3. Получение компетентных клеток Escherichia coli
3.3.4. Трансформация компетентных клеток Escherichia coli
3.3.5. Выделение никазы N.BspD61
3.3.6. Фрагмент гена никазы
3.3.7. Приготовление ДНК-белкового комплекса
3.3.8. Атомно-силовая микроскопия
Глава 4. Экспериментальная часть
4.1. Фототрофные пурпурные бактерии
4.1.1. Исследование влияния трансформации на морфологию
поверхности
4.1.1.1. Модификации клеток Rhodobacter sphaeroides методом конъюгация
4.1.1.2. ТЭМ и АСМ клеток Rbodabacter sphaeroides
4.1.1.3. Определение хемотипа культуры
4.1.2. Исследование фотосинтетического аппарата фототрофных бактерий

наносили из капли рабочего раствора (раствора буфера, водно-спиртовой среды и т.п.) на поверхность слюды, модифицированной катионами двух- (и более) валентных металлов - М§2+, Мг+, Хпъ Со2+, Ьа3+, 2г4' [42]. Эти ионы, по-видимому, служат связующими мостиками между отрицательно заряженной слюдой (в водных растворах) и отрицательно заряженными фосфатными группами молекулы ДНК (рис. 11).
Рисунок 11. Схема иммобилизации молекул ДНК на поверхности слюды с использованием катионов двухвалентных металлов.
Модификация слюды может предшествовать процессу адсорбции макромолекул - в этом случае свежесколотую слюду помещают для предварительной обработки на некоторое время (минуты, часы) в раствор, содержащий катионы металлов, затем промывают (водой, водным раствором этанола и пр.) и высушивают. После этого на модифицированную поверхность наносят рабочий раствор с исследуемыми структурами. Другой подход - добавление солей металлов непосредственно к рабочему раствору -позволяет исключить этап предварительной обработки слюды (препарат наносят непосредственно на поверхность свежего скола). После высыхания капли рабочего раствора образцы, как правило, подвергают дополнительной промывке. Сравнение двух упомянутых вариантов показывает предпочтительность второго - добавление солей металла непосредственно в наносимый на поверхность раствор, без предварительной обработки слюды. При этом молекулы оказываются более стабильными к промывке водой, менее запутанными и перекрученными.
Другая широко используемая методика химической модификации подложки для стабилизации молекул нуклеиновых кислот на поверхности -это силанизация слюды [43; 44]. Процесс силанизации существенно не
молекула

ионы металла
Ме2+
поверхность слюды