Исследование кальциевой сигнализации культивируемых белых адипоцитов. Конвергенция сигнальных путей, сопряженных с IP3- и рианодиновыми рецепторами.

• Автор: Туровский, Егор Александрович
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 132 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1Л Гормоны и медиаторы жировой ткани

1.2 Дисрегуляция жировой ткани

1.3 Регуляция липидного обмена в адипоцитах

1.3Л Метаболический контроль

1.3.2 Ковалентная модификация

1.3.3 Генетический контроль

1.4 Липотоксичность свободных жирных кислот

1.5 Метаболизм адипоцитов белой жировой ткани
1.6 Базальный липолиз, рециркуляция TAG = FFA и футильные циклы
1.7 Адренергические рецепторы
1.7.1 сц-адренергические рецепторы
1.7.2 йг-адренергические рецепторы
1.7.3 Р-адренергические рецепторы
1.8 Ацетилхолиновые мускариновые рецепторы. Структура и функции
1.9 Синтетазы оксида азота и NO-цГМФ сигнальный путь
1.9.1 Структура и подтипы синтетаз оксида азота 3
1.9.2 Оксид азота как вторичный мессенджер
1.9.3 Активируемая оксидом азота цитозольная гуналатциклаза
и их активированными производными
1.9.4 Протеинкиназа G
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Выделение и культивирование клеток
2.1.1 Выделение и культивирование преадипоцитов белой жировой ткани
2.2 Флуоресцентная микроскопия
2.2.1 Регистрация уровня цитозольного кальция
2.2.2 Измерение продукции оксида азота (N0)
2.3. Система аппликации и отмывки веществ
2.4. Обработка цифровых изображений и графические построения
2.5 Использованные реактивы
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
3.1. Увеличение [Са2+], под действием норадреналина
3.1.1. Кальциевые ответы адипоцитов на агонисты ai-адренергических рецепторов. Вклад сцд-адренорецепторов
3.1.2. Са2+-ответы белых адипоцитов на агонисты а2-адренергических рецепторов. Исследование пути передачи сигнала
3.1.3. Рецептор-опосредованное действие Ь-аргинина на белые адипоциты мыши

3.1.4. Роль р-адренергических рецепторов в кальциевой сигнализации белых адипоцитов
3.2. Холинергическая сигнализация в культивируемых белых адипоцитах мыши
3.2.1. Са2+-сигналы, генерируемые бельми адипоцитами в ответ на ацетилхолин
3.2.2. Определение рецептора ацетилхолина, участвующего в формировании Са2+-сигнала
3.2.3. Исследование внутриклеточного пути передачи сигнала с Мз-типа холинорецептора адипоцитов
3.2.3.1. Вклад Ж>-сОМР сигнального пути в передачу сигнала с Мз-холинергических рецепторов
3.3. Конвергенция сигнальных путей, сопряженных с 1Р3- и ИуЛ рецепторами в адипоцитах мыши
3.3.1. Конвергенция сигнализации Мз-холинорецепторов и щ-адренорецепторов
3.3.2. Конвергенция сигнализации Мз-холинорецепторов и а2-адренорецепторов
3.3.3. Конвергенция сигнализации Мз-холинорецепторов и РьРз-адренорецепторов
ВЫВОДЫ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ЛИТЕРАТУРА
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Ожирение рассматривается как один из основных факторов высокой смертности населения вследствие развития неалкогольного стеатогепатита, диабета 2-го типа и сердечно-сосудистых заболеваний (.Асташкин и Глезер, 2008; Boguszewski el al., 2010). Развитие этих заболеваний при ожирении обусловлено «дислипидэмией» - избытком циркулирующих в крови токсинов — жирных кислот.
Гипертрофия и дисфункция белой жировой ткани (WAT) несет в себе большой патогенный потенциал, ввиду ее неспособности эффективно устранять из крови жирные кислоты, а также за счет трансформации эндокринных и иммунных функций жировой ткани (Bays et al., 2008).
Известно, что симпатическая нервная система и нейротрансмиггер норадреналин (НА) играют важную роль в процессе липолиза WAT (Tavernier et al., 2005). Модулирующий эффект норадреналина на функции жировой клетки является комплексным и вовлекает не только различные подтипы адренорецепторов, но и различные системы трансдукции сигнала. В ряде работ показано, что липолиз, стимулированный норадреналином, обеспечивается активацией (3-адренорецепторов, аденилатциклазы и синтезом сАМР, а также ключевых липаз HSL и ATGL и фосфорилированием перилипина. Ингибирование этого процесса обеспечивается в результате активации сц-адренорецепторов, гетеротримерного белка Gj, щ-субъединицы, ингибирующей аденилатциклазу и синтез сАМР. Важную роль в процессах передачи сигналов от рецептора к мишеням играют и Ру-субъединицы Gj-белков. В последние годы стало известно, что липолиз также может быть стимулирован предсердным натрийуретическим пептидом с последующим накоплением cGMP и активацией протеинкиназы G ( Wong and Fiscus, 2011).
Что касается парасимпатической нервной системы и ее нейротрансмитгера, ацетилхолина, то кроме ингибирования процесса липолиза, о его действии на жировые клетки ничего не известно.
Роль Са2+ в регуляции липолиза и липогенеза белой жировой ткани практически не исследована, несмотря на то, что в роли вторичного мессенджера кальций опосредует действие более 100 нейротрансмитгеров и гормонов и регулирует многочисленные клеточные функции. Считается, что рост Са2+ должен приводить к ингибированию липолиза протеинкиназой CaMKII и Са2+-зависимыми фосфодиэстеразами (PDEIII, IV),

на фоне повышенного метаболизма, двигательной деятельности и температуры тела. Содержание таких мышей на высококалорийной диете не приводит к увеличению массы тела, тогда как у дикого типа наблюдаются все признаки ожирения (Gautam et al., 2006).
В дифференцированных клетках линии ЗТЗ показана экспрессия Mi- М3-, М4-холинорецепторов, причем количество мРНК Мз-холинорецепторов почти в 9 раз увеличивается в процессе дифференцировки клеточной линии в белые адипоциты, тогда как мРНК Mi и М^холинорецепторов меняется незначительно. Предполагается, что ацетилхолин играет важную роль в процессе адипогенеза клеток линии ЗТЗ (Stephens et al, 2009).
На культивируемых белых адипоцитах крысы, полученных из мезенхимальной фракции клеток показано, что аппликация ацетилхолина дозозависимо приводит к уменьшению концентрации глицерола в экстраклеточной среде и увеличению потребления глюкозы клетками. Ацетилхолин на фоне антагонистов Мз-холинорецепторов приводит к потреблению глюкозы клетками на нормальном уровне, тем самым свидетельствуя о рецепторном действии ацетилхолина. Кроме того, преинкубирование адипоцитов в присутствии инсулина с ингибиторами PLC или РКС, как ключевыми ферментами сигнального каскада от инсулина и ацетилхолина, отменяло эффект ацетилхолина, что выражалось в уменьшении потребления глюкозы (Yang et al., 2009).
В соответствии с вышесказанным, в белой жировой ткани существует иннервация парасимпатической нервной системой, а также экспрессия ацетилхолиновых мускариновых рецепторов. Активация или ингибирования путей трансдукции данных рецепторов приводит к изменению метаболизма белой жировой ткани. В тоже время, пути передачи сигналов с мускариновых рецепторов являются частью кальциевой сигнализации, которая практически не исследована для клеток белого жира.