Формирование активного фотопротеинового комплекса на примере обелина и акворина и их мутантных форм

• Автор: Еремеева, Елена Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Красноярск
• Количество страниц: 121 с. : ил.

ГЛАВА 1.

ГЛАВА 2.
2Л. 2.2.

Са2+-регулируемые фотопротеины и перспективы

использования собственной флуоресценции белков

для их изучения

Са2+-регулируемые фотопротеины

Пространственная структура Са2' -регулируемых

фотопротеинов

Возможные пути формирования 2-гидроперокси-целентеразина
Механизм биолюминесценции Са2+-регулируемых фотопротеинов
Спектральные свойства ароматических аминокислот и собственная флуоресценция белков
Тушение собственной флуоресценции и ее использование для изучения свойств белков
Использование собственной флуоресценции для изучения биолюминесцентных белков
Материалы и методы
Олигонуклеотид-направленный мутагенез
Приготовление компетентных клеток E. coli XLI-Blue и BL21 Gold и их трансформация плазмидной ДНК
Выделение плазмидной ДНК
Культивирование клеток E. coli, выделение и очистка белков
ГЛАВА
ГЛАВА

2.5. Изучение кинетики активации апофотопротеинов
2.6. Измерение собственной флуоресценции
апофотопротеинов
2.7. Измерение удельной биолюминесцентной активности
2.8. Метод остановленной струи (эиэрреб-Лолу)
2.9. Измерение спектральных характеристик
апофотопротеинов и их мутантных форм
2.10. Реактивы
3. Исследование регенерации обелина и акворина из
апофотопротеина, целентеразина и молекулярного кислорода
3.1. Собственная флуоресценция апообелина и
апоакворина
3.2. Вклад каждого остатка триптофана в собственную
флуоресценцию апообелина
3.3. Тушение собственной флуоресценции
апофотопротеинов акриламидом
3.4. Тушение собственной флуоресценции апообелина и
апоакворина целентеразином и определение кажущихся констант диссоциации соответствующих комплексов
3.5. Кинетика формирования активного фотопротеинового
комплекса из апофотопротеина, целентеразина и кислорода
4. Исследование роли отдельных аминокислотных остатков (ІІІЗІ75, Туг190 и Тгр179) в образовании

активного фотопротеинового комплекса
4.1. Выделение и очистка мутантных форм обелина и акворина
4.2. Относительная биолюминесцентная активность мутантов обелина и акворина
4.3. Люциферазоподобная и фотопротеиновая биолюминесцентные активности мутантов
4.4. Са2+-независимая люминесценция мутантов обелина
4.5. Спектры поглощения мутантов акворина и обелина
4.6. Кинетика биолюминесценции мутантов акворина и обелина
4.7. Спектры биолюминесценции мутантов акворина и обелина
4.8. Спектры флуоресценции Са2+-разряженных мутантов акворина и обелина
4.9. Константы диссоциации комплекса апофотопротеин-целентеразин и константы скорости образования активного фотопротеинового комплекса мутантов обелина
4.10. Функциональная роль остатков His и Туг в формировании активного фотопротеинового комплекса
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА

ДТТ с фиксированным pH 6,5 для каждого используемого значения температуры (4, 10, 15 и 20°С).
Концентрации кислорода в активационном растворе при различных температурах вычисляли с помощью уравнения Генри, при расчетах использовали значение давления 0,97 атмосферы. Константы растворимости для кислорода в воде при различных температурах были взяты с
2.6. Измерение собственной флуоресценции апофотопротеинов
Измерение собственной флуоресценции апофотопротеинов проводили на спектрофлуориметре AMINCO (Thermo Spectronic, США), оснащенном системой контроля температуры, в буфере 5 мМ ЭДТА, 10 мМ ДТТ, 20 мМ Трис-НС1, pH 7,0 при 20°С. Длина волны возбуждения - 295 нм, ширина щели — 4 нм, спектр записывали в диапазоне от 300 до 500 нм. Все спектры флуоресценции получены с использованием стандартной кварцевой кюветы (1x1 см) при постоянном перемешивании в начальном объеме 1 мл, к которому затем добавляли раствор целентеразина порциями от 1 до 5 мкл вплоть до насыщения. Во всех измерениях использовали постоянную концентрацию апобелка - 1,22 мкМ. Все спектры флуоресценции были скорректированы на спектральную чувствительность ФЭУ с помощью программного обеспечения прибора. Кроме того, спектры корректировали на разведение образца за счет добавления раствора целентеразина и на влияние метанола на триптофановую флуоресценцию апобелков. Для того чтобы оценить тушение флуоресценции, использовали изменения в интенсивности излучения на 336 нм.
Для того чтобы исключить влияние эффекта внутреннего фильтра, наблюдающегося при взаимодействии белка и лиганда, и провести