Роль анионного канала в транспорте супероксида из митохондрий в условиях кальциевого стресса

• Автор: Тикунов, Андрей Петрович
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 106 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ.
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Роль МИТОХОНДРИЙ В ПРОЦЕССЕ ЗАПРОГРАММИРОВАННОЙ СМЕРТИ КЛЕТКИ

Прекращение транспорта электронов и энергетического метаболизма

Высвобождение каспаз-активирующих белков

Активные формы кислорода и клеточный окислительно-восстановительный потенциал

Изменение проницаемости внутренней мембраны митохондрии

Факторы, влияющие на изменение проницаемости митохондрий

Роль супероксид-радикала в митоптозе и апоптозе

Источники супероксид-радикапа в клетке

Митохондриальные источники супероксида
Механизмы утилизации супероксид-радикала
Витамин Е - альфа-токоферол
Супероксиддисмутаза
Цитохром С
Каталаза
Глютатионпероксидаза
Выход супероксид-радикала через потенциал-зависимый анионный канал в цитоплазму
Строение потенциал-зависимого анионного канала митохондрии
Регуляция потенциал-зависимого анионного канала
ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ
Цель работы:

Задачи исследования:
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Реагенты и материалы
Получение митохондрий печени крысы
Измерение кальций-индуцированного набухания митохондрий
Измерение уровня супероксид-радикала (02*‘) в митохондриях
Определение проницаемости внешней митохондриальной мембраны методом фильтрации
митохондрий через силиконовое масло
Измерение разбухания митохондрий при пониженной температуре
Вестерн блот анализ выхода цитохрома С из митохондрий
Статистическая обработка данных

РЕЗУЛЬТАТЫ
Кальций-индуцированное изменение проницаемости митохондрии
Зависимость от концентации кальция
Представление результатов
Ингибитор анионного канала 63139
Изменение проницаемости внешней митохондриальной мембаны при обработке митохондрий
ИНГИБИТОРОМ 63139
Влияние ингибирования потенциал-зависимого анионного канала на процесс Са2+-
индуцированного изменения проницаемости митохондрий
Влияние обработки митохондрий ингибитором 63139 на транспорт кальция
Проверка предположения о том, что 63139 может формировать канал во внешней мембране
митохондрии независимо от формирования поры повышенной проницаемости митохондрии
Дозовая зависимость эффекта 63139 НА изменение проницаемости митохондрий
Компенсирующее влияние антиоксиданта на ингибирование проницаемости внешней мембраны

МИТОХОНДРИЙ
Использование дигидроэтидина для определения скорости производства супероксида дыхательной цепью митохондрий, определение места реакции супероксида с ДГЭ в
митохондриях
Влияние ингибитора анионного канала на уровень супероксида внутри митохондрии
Порформирующий агент уменьшает накопление 02- в митохондриях, вызываемое ингибированием потенцал-зависимого анионного канала с помощью 63139
ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
Зависимость флуоресценции кальцеина от его концентрации в растворе
Использование дигидроэтидина в качестве детектора уровня супероксида
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

конечных концентраций добавленного Са2+ 0, 100, 150, 200, 250 и 300 мкМ. Общий объем смеси в ячейке был равен 200-206 мкл. Планшет помещался в планшетный ридер FLUOS7ar (BMG Labtech, Durham, NC, USA) и записывалась кинетика изменения оптической плотности митохондриальной суспензии на длине волны 544 нм.
Измерение уровня супероксид-радикала (02*“) в митохондриях.
Суспензия выделенных митохондрий печени крысы разводилась в МИБ до конечной концентрации белка 1 мг/мл и преинкубировалась в присутствии или отсутствии модификаторов в течение 4 минут при комнатной температуре. По прошествии этого времени к инкубационной суспензии добавлялся мембранопроницаемый, флуоресцентный, специфичный к супероксиду краситель дигидроэтидин (ДГИ) (Invitrogen, Eugene, OR, USA) до конечной концентрации 2 мкМ. После перемешивания, суспензия выдерживалась ещё 1 минуту и переносилась в 96 луночный белый иммунологический планшет, в лунках которого уже находился раствор антимицина А, дающий конечную концентрацию 1 мкг/мл. Ингибитор комплекса III электрон транспортной цепи митохондрии антимицин А был добавлен для стимуляции производства супероксида (см. «Обсуждение»), Уровень супероксид-радикала оценивается по интенсивности флуоресценции продуктов окисления дигидроэтидина при X возбуждения 485 нм и А, испускания 590 нм, используя 96 луночный белый иммунологический планшет и мультиканальный флюориметрический ридер FLUOiS'tar (BMG Labtech, Durham, NC, USA). Таким образом, количество супероксид-радикала измеряется и представляется в виде условных (относительных) флуоресцентных единиц (УФЕ) а скорость производства Ог'~ определяется как УФЕ/мин.