Резистентность опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу в конфлюентных культурах

• Автор: Фадеев, Роман Сергеевич
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 117 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Цитокин Apo2L/TRAIL

1.1.1 Apo2L/TRAIL лиганд

1.1.2 Рецепторы к TRAIL/Apo2L

1.1.3 Основной сигнальный путь TRAIL

1.1.4 Альтернативный сигнальный путь TRAIL

1.1.4.1 Активация NF-kB сигнального пути

1.1.4.2 Активация PI3K-Akt сигнального пути

1.1.4.3 Активация МАРК сигнального пути

1.1.5 Резистентность опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу
1.1.5.1 Сигнальные пути, принимающие участие в подавлении TRAIL-индуцированного апоптоза
1.1.5.1.1 NF-kB сигнальный путь
1.1.5.1.2 Akt/PKB сигнальный путь
1.1.5.1.3 МАРК сигнальный путь
1.1.5.1.4 mTOR сигнальный путь
1.1.5.1.5 c-FLIPhIAPs
1.1.5.1.6 GSK3a-GSK3p сигнальный путь
1.1.6 Цитокин TRAIL как терапевтический препарат
1.2 Приобретенная резистентность опухолевых клеток
1.2.1 Резистентность опухолевых клеток в конфлюентных культурах
1.2.2 Резистентность опухолевых клеток в многоклеточных агрегатах
1.2.2.1 Механизмы резистентности опухолевых клеток в многоклеточных агрегатах
1.2.2.1.1 Механизмы опосредованные контактными взаимодействиями клеток
1.2.2.1.2 Механизмы опосредованные ограничениями транспорта веществ в многоклеточных агрегатах
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Материалы
2.2 Получение рекомбинантного белка izTRAIL
2.3 Культура клеток
2.4 Получение культуры нормальных диплоидных фибробластов человека
2.5 Оценка цитотоксичности
2.6 Морфологический флуоресцентный анализ апоптоза
2.7 Анализ митотической активности
2.8 Ki67p-GFP репортерная система

2.9 Трансфекция клеток
2.10 Проточная цитофлуориметрия
2.11 Анализ содержания кислорода в среде культивирования клеток
2.12 Статистический анализ
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
3.1 Избирательность апоптоз-индуцирующего действия рекомбинантного белка izTRAIL на опухолевые клетки
3.2 Повышение резистентности опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу в конфлюентных культурах
3.3 Выяснение связи TRAIL- резистентности опухолевых клеток в конфлюентных культурах с пролиферацией клеток
3.4 Роль адгезии опухолевых клеток и околоклеточного микроокружения в формировании резистентности к TRAIL-индуцированному апоптозу
3.5 Роль внутриклеточных сигнальных путей в формировании TRAIL-резистентности опухолевых клеток в конфлюентных культурах
3.6 Подавление конфлюентной резистентности опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу мультикиназным ингибитором сорафенибом и ингибитором гистондиацетилазы SAHA
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ФИНАНСОВАЯ ПОДДЕРЖКА РАБОТЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
Онкологические заболевания занимают второе место в мире по смертности после сердечно-сосудистых патологий. Недостаточная эффективность лечения онкологических заболеваний обусловлена в первую очередь отсутствием избирательного действия существующих противоопухолевых препаратов, недостаточно эффективным проникновением противоопухолевых субстанций в опухолевую ткань и возникновением при определенных условиях резистентности опухолевых клеток к повреждающим воздействиям. Возникновение резистентности опухолевых клеток к действию химиотерапевтических препаратов связывают, в первую очередь, с внутриклеточными механизмами активации и/или повышенной экспрессии белков-транспортеров суперсемейства ABC (Р-гликопротеина (Pgp), MRP1-MRP-5, BCRP и LPR), осуществляющих выведение ксенобиотиков различного происхождения из клетки (Gottesman et al., 2002). С другой стороны, известно повышение резистентности опухолевых клеток к различным повреждающим воздействиям в двумерных (конфлюентные культуры распластанных клеток) и трехмерных (сфероиды) многоклеточных образованиях в условиях in vitro, отражающее резистентность клеток в опухолевой паренхиме к действию химиотерапевтических препаратов (Chitcholtan et al., 2012), окислительного стресса (Акатов и др., 2003), гипертермии (Olive et al., 1985), радиации (Dertinger et al., 1975). Это говорит об общности механизмов повышения резистентности опухолевых клеток к различным повреждающим воздействиям в плотных многоклеточных образованиях. Механизм такой резистентности до сих пор остается не выясненным. В настоящее время одним из наиболее перспективных подходов противоопухолевой терапии является потенциальное применение рекомбинантных белков, созданных на основе цитокина TRAIL (TNF alpha Related Apoptisis Inducing Ligand).

действия TRAIL при использовании препаратов (веществ) повышающих чувствительность опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу.
Применение таких не токсичных для организма в целом препаратов позволит не только повысить противоопухолевую эффективность TRAIL, но и минимизировать побочные действия, возникающие при использовании классической химиотерапии. Следует отметить, что наиболее перспективными в этом направлении можно считать нетоксичные для нормальных клеток организма комбинации таргетных препаратов с препаратами, полученными на основе цитокина TRAIL.
1.2 Приобретенная резистентность опухолевых клеток
Опухолевые клетки при определенных условиях могут приобретать устойчивость (резистентность) к действию не только ксенобиотиков (химиотерапевтические препараты), но и к физическим факторам воздействия, таким как гипертермия (Olive et al., 1985) и ионизирующее излучение (Dertinger et al., 1975). Приобретенная резистентность характерна для опухолевых клеток, находящихся в условиях многоклеточных агрегатов (Multicellular resistance (MCR)) (Kobayashi et al., 1993) или в плотных конфлюентных культурах (Confluence-Dependent Resistance, CDR) (Dimanche-Boitrel et al., 1992). Основной причиной возникновения такой резистентности принято считать остановку клеток в точке рестрикции на границе Gi/S и переход в состояние покоя (Go). (Hambek et al., 2006, Chen et al., 2011). Такая остановка в клеточном цикле происходит в результате активации белков-ингибиторов циклин зависимых киназ (CDKI), специфичных для сверочной точки Gi/S. Такими белками являются р21С1р1 , активируемый при нарушениях синтеза ДНК, и p27Kipl, активируемый при формировании межклеточных контактов (Sherr et al., 1995). В таком