Контролируемое высвобождение фактора роста костной ткани rhBMP-2 из коллаген-содержащего имплантируемого материала и его влияние на иммунную систему

• Автор: Осидак, Егор Олегович
• Шифр специальности: 14.03.09, 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 127 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. ТКАНЕВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ
1.2. КОМПОНЕНТЫ ВНЕКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА КОСТИ И ИХ ФУНКЦИИ

1.3. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КОСТНЫХ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИХ БЕЛКОВ
1.4. СПОСОБЫ УДЕРЖАНИЯ ФАКТОРОВ РОСТА В КОЛЛАГЕНОВЫХ ИМПЛАНТАТАХ И МЕХАНИЗМЫ ВЫСВОБОЖДЕНИЯ
1.5. ВОЗМОЖНЫЕ ИММУННЫЕ РЕАКЦИИ НА КОЛЛАГЕНОВЫЕ МАТЕРИАЛЫ СОДЕРЖАЩИЕ КНВМР-2 И СПОСОБЫ ИХ ОЦЕНКИ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
2Л МАТЕРИАЛЫ
2.2 МЕТОДЫ
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1 ТЕСТИРОВАНИЕ ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ КРОЛИЧЬИХ АНТИТЕЛ К КНВМР-2
3.2 ТЕСТИРОВАНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ЯНВМР-2
3.3 МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ЯНВМР-2 В ПЛАЗМЕ И СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ
3.4 ОПИСАНИЕ ЧЕЛОВЕЧЕСКОЙ ПЛАЗМЫ КРОВИ БЕЗ КОЛЛАГЕН-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ И БЕЗ ФИБРОНЕКТИНА
3.5 МЕТОД ОЦЕНКИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ КНВМР-2 С КОЛЛАГЕНОМ
3.6 МЕТОД ОЦЕНКИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ КНВМР-2 С ФИБРОНЕКТИНОМ
3.7 ВЫСВОБОЖДЕНИЕ RHBMP-2 ИЗ КОЛЛАГЕНОВЫХ НОСИТЕЛЕЙ
IN VIVO
3.8 МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ АНТИТЕЛ К RHBMP-2 В СЫВОРОТКЕ КРОВИ КРЫС
3.9 ОЦЕНКА ТКАНЕВЫХ РЕАКЦИЙ ОРГАНИЗМА НА ВВЕДЕНИЕ КОЛЛАГЕНОВОГО ГИДРОГЕЛЯ С RHBMP-2 И ФИБРОНЕКТИНОМ IN VIVO

ГЛАВА 4. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ
4.1. ВВЕДЕНИЕ
4.2 КАЧЕСТВЕННОЕ ОПИСАНИЕ МОДЕЛИ
4.3 ПОСТУЛАТЫ МОДЕЛИ
4.4 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЗНАЧЕНИЙ ПАРАМЕТРОВ СИСТЕМЫ УРАВНЕНИЙ
4.5 ЧИСЛЕННОЕ РЕШЕНИЕ
4.6 СРАВНЕНИЕ РЕШЕНИЯ МОДЕЛИ С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМИ ДАННЫМИ
4.7 ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
5.1 РОЛЬ ФИБРОНЕКТИНА В КОНТРОЛИРУЕМОМ ВЫСВОБОЖДЕНИИ RHBMP-2 ИЗ КОЛЛАГЕНОВОГО ИМПЛАНТАТА.
5.2 АДЕКВАТНАЯ ПРЕЗЕНТАЦИЯ RHBMP-2 ПОЗВОЛЯЕТ УМЕНЬШИТЬ КОЛИЧЕСТВО ИСПОЛЬЗУЕМОГО РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА.
ГЛАВА 6. ВЫВОДЫ
ГЛАВА 7. ЛИТЕРАТУРА

Введение
Актуальность проблемы:
Костная ткань является одной из немногих тканей организма взрослого человека, которая может спонтанно восстанавливаться при полученном повреждении, если размер дефекта не превысит критического (от 1 см2). В противном случае, в результате полученной травмы (например, переломы позвонков) или болезни (например, остеохондроз позвоночника или дегенеративное заболевание межпозвонкового диска) самостоятельная регенерация костной ткани без оперативного вмешательства становится невозможной. Для ускоренного восстановления поврежденной костной ткани в зоне регенерации необходимо продолжительное время поддерживать достаточную концентрацию биологически активных соединений - факторов роста. Группа костных морфогенетических белков (Bone Morphogenic Proteins, BMP) регулирует регенерацию костной ткани [Зайцев и др., 2009]. ВМР-2 индуцирует дифференцировку мезенхимальных клеток в хондрогенные и остеогенные клетки, а также способствует пролиферации остеобластов [Chen et. al., 2004]. Рекомбинантный ВМР-2 человека (rhBMP-2) используется в клинике при лечении костных повреждений с 2000 года [Boden et. al., 2000]. С момента создания рекомбинантных факторов роста, их использование в клинической практике вызывало обеспокоенность у врачей в связи с возможной индукцией иммунного ответа при их введении в организм [Poynton et. al., 2002]. При оценке иммуногенности rhBMP-2 необходимо учитывать свойства этого фактора роста, отличающие его от других терапевтических рекомбинантных белков. Например, большинство терапевтических рекомбинантных белков используются при полном отсутствии или низкой экспрессии нативной формы данного белка в организме, a rhBMP-2 были разработаны специально для индукции остеогенеза при спондилодезе [White et. al., 2007]. Таким образом, rhBMP-2 должны действовать локально, в месте имплантации композита, чтобы индуцировать формирование новой костной ткани в месте повреждения костной ткани, в то время как другие терапевтические рекомбинантные белки действуют системно. Рекомбинантный ВМР-2, как и

которыми заключена жидкая фаза. Жидкая фаза, заключенная в сообщающиеся друг с другом поры между молекулами каркаса, представляет собой непрерывную среду, в которой могут перемещаться растворенные в ней молекулы. Молекулы белков, инкорпорированные в коллагеновый матрикс и не взаимодействующие с фибриллами, перемещаются относительно молекул матрикса за счет диффузии [93]. При наличии направленного потока жидкой фазы относительно матрикса, молекулы переносятся вместе с потоком. Такой конвекционный перенос может возникнуть in vivo из-за градиента давления, контракции или набухания геля, или механических нагрузок, сжимающих или растягивающих гель. Таким же образом осуществляется транспорт сигнальных биомолекул с потоками внеклеточной жидкости внутри тканей.
1.4.1.1. Диффузионный перенос
Первое использование коллагеновых гелей для местного введения и пролонгирования лекарственных средств относится к 60-м годам. Тогда начались исследования диффузионных характеристик коллагеновых гелей. Авторы [94] изучали зависимость коэффициента диффузии белков от размера фибрилл и величины пор. Дальнейшие работы по диффузионному и конвекционному переносу в коллагеновых гелях связаны также с изучением транспорта макромолекул в опухолях [95].
Степень замедления диффузии макромолекул в геле зависит от микроструктуры матрикса, то есть, от размера пор, объемной доли пор и размера фибрилл. Из-за препятствий путь макромолекулы в данном направлении становится больше, чем в отсутствие матрикса, и поэтому эффективный коэффициент диффузии становится меньше, чем в растворе [84]. Существуют теоретические модели для расчета коэффициента диффузии в зависимости от характеристик геля [96].
Стоит отметить, что коэффициент диффузии практически не зависит от того, произошло ли гелеобразование раствора коллагена [95], а зависит от процентного