Структура и функции белка VirE2 в переносе оцДНК в эукариотические клетки

• Автор: Гусев, Юрий Сергеевич
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 109 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений и обозначений

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Агробактериальная трансформация

1.1.1 Перенос ДНК через мембраны растительной клетки

1.2 Роль белка TrE2 в процессе агробактериалыюго переноса Т-ДНК

1.3 Перенос Т-ДНК в животную клетку

1.4 Перенос ДНК через нанопоры

1.5 Эндоцитоз

1.6 Трехмерная структура бгЕ2 белка по данным рентгеноструктурного анализа
1.7 Метод молекулярной динамики
1.7.1 Молекулярная динамика мембранных белков
1.8 Метод нормальных мод
1.8.1 Применение метода нормальных мод для анализа каналов и пор
1.9 Заключение
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Выделение и очистка белка ТгЕ
2.2 Выращивание культур животных клеток
2.3 Измерение флуоресценции у животных клеток
2.4 Статистика
2.5 Электронная просвечивающая микроскопия комплекса оцДНК-У1гЕ2
2.6 Программные средства для молекулярного моделирования
2.7 Молекулярная динамика белка ТгЕ
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Построение комплекса из двух белков У1гЕ2 в программе 011АММ-Х
3.2 Построение комплекса из четырех белков У1гЕ2 в программе ОЯАММ-Х

3.3 Построение комплекса из шести белков VirE2 в программе GRAMM-X
3.4 Компьютерное моделирование комплексов из белка VirE2 и оцДНК
3.5 Построение модели белков VirE2-VirEl в мембране в программе CHARMM-GUI
3.6 Проверка белка VirE2 на корректность для работы методом МД
3.7 Возможные пробелы в структуре белков VirE2-VirEl
3.7.1 Контакты атомов в структуре белков VirE2-VirEl
3.8 Молекулярная динамика белка VirE
3.8.1 Анализ результатов молекулярной динамики
3.9 Исследование конформационных изменений комплексов из белка VirE2-VirEl методом нормальных мод
3.9.1 Исследование комплекса белков VirE2-VirEl методом нормальных мод
3.9.2 Исследование комплекса из двух белков VirE2 методом нормальных мод
3.9.3 Исследование комплекса из четырех белков VirE2 методом нормальных мод
3.10 Результаты моделирования
3.11 Анализ переноса оцДНК с участием белка VirE2 через
мембраны in vitro
3.11.1 Эксперименты по переносу оцДНК с участием белка VirE2 и его комплексов через мембраны животных клеток
3.12 Электронная просвечивающая микроскопия комплекса
оцДНК-УнЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ
Т-ДНК — транспортная ДНК
РСА - рентгеноструктурный анализ
оцДНК - одноцепочечная ДНК
дцДНК - двухцепочечная ДНК
а.о. - аминокислотный остаток
п.о. - пара оснований
н.о. - нуклеотидное основание
МД - молекулярная динамика
ПЦР - полимеразная цепная реакция
СЕФ - стандартная единица флуоресценции
АТФ - аденозинтрифосфат
ТЭМ - трансмиссионная электронная микроскопия

образованный четырьмя пептидами мелитина. В течение моделирования комплекс распадался на тример и мономер мелитина. Особенно активной областью исследований стало изучение формирования ионных каналов, встроенных в липидную мембрану.
В работах [Woolf, Roux, 1996; Chiu et al., 1999] изучается комплекс канала грамицидина А, встроенного в мембрану, окруженного молекулами воды. Было показано, что область раздела фаз мембрана-растворитель составляет около 15 ангстрем. Кроме того, было установлено, что полная энергия взаимодействия между грамицидином и индивидуальными липидами колеблется от 0 до -50 ккал/моль. Наиболее энергетически выгодное взаимодействие между липидами и белками включает почти равные взносы Ван-дер-Ваальсовых и электростатических взаимодействий.
Калиевые К+ каналы являются одной из основных широко изучаемых моделей ионных каналов. В статье [Bemèche, Roux, 2000] описываются результаты МД атомной модели калиевого канала KcsA Kl, встроенного в мембрану (рисунок 1.11). Во всех моделированиях трехмерная структура KcsA Kl в мембране была очень стабильна. В частности, среднеквадратичное отклонение структуры тетрамера составляет по отношению к кристаллографической структуре порядка 1,9 Â. Такая стабильность является признаком того, что упаковка KcsA достаточно точна, несмотря на умеренное разрешение рентгеновских данных.