Функциональная и регенеративная активность нейронов после криоконсервации изолированного мозга моллюска Lymnaea stagnalis L.

• Автор: Ивличева, Наталья Александровна
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 94 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1Л. Криоконсервация. Биофизические аспекты

1Л.1. Основные этапы криоконсервации

1 Л.2. Причины повреждений клеток при замораживании

1 Л.3. Кристаллизация воды

1Л .3Л. Кристаллы и микрочастицы льда в процессе замораживания

1Л.3.2. Рекристаллизация

1Л.4. Режимы замораживания-оттаивания (скорости)

1Л.4Л. Низкие скорости замораживания

1Л.4.2. Высокие скорости замораживания. Витрификация
1Л.4.3. Режимы замораживания нервных клеток и ткани
1 Л.5. Протекторы
1Л.5Л. Основные свойства криопротекторов
1Л.5.2. Криопротекторы, используемые для защиты нервных
клеток и ткани при криоконсервации
1Л.5.3. Протекторные добавки в криозащитные среды
1.2. Современное состояние и перспективы криоконсервации
нервной ткани
1.2.1. Криоконсервация эмбриональных нервные клеток и ткани
1.2.2. Криоконсервация дифференцированной нервной ткани
1.2.3. Криоконсервация нервных стволовых клеток
1.2.4. Использование альтернативных объектов для изучения последствий криоконсервации
Заключение
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ и МЕТОДЫ
2.1. Объект исследования
2.2. Метод криоконсервации, замораживания-оттаивания,

изолированного мозга моллюска
2.3. Метод органотипического культивирования изолированного мозга моллюсков
2.4. Культивирование дифференцированных нейронов изолированного мозга взрослого прудовика
2.5. Оценка жизнеспособности нейронов в культуре клеток
2.6. Тестирование жизнеспособности нейронов в интактном мозге моллюска методом прижизненного окрашивания Live/Dead
2.7. Метод внутриклеточного отведения мембранных потенциалов
2.8. Обработка мозга пептидом TSKY
2.9. Криомикроскопия
2.10. Методы оценки ошибок измерений и программное обеспечение
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Выживаемость нейронов в клеточной культуре после
криоконсервации мозга с использованием ДМСО и криомикроскопия протектирующих растворов
3.2. Морфофункционалыюе состояние нейронов в ганглиях моллюска после криоконсервации в жидком азоте
(тестирование жизнеспособности с применением витального красителя kit Live/Deacl)
3.3. Электрические параметры нейронов переживающего мозга моллюска в органной культуре
3.3.1. Изучение электрических характеристик нейронов в органной культуре изолированного мозга моллюска без криоконсервации
3.3.2. Изучение электрических характеристик нейронов в органной культуре после криоконсервации изолированного мозга моллюска
3.4. Анализ регенеративной активности изолированных нейронов клеточной культуре in vitro до и после криоконсервировации

мозга моллюска
3.5. Влияние пептида ТБКУ на жизнеспособность изолированных нейронов
3.5.1. Эффекты пептида ТБКУ в зависимости от температуры при предварительной инкубации ганглиев моллюска (22-24°С и 4-6°С)
3.5.2. Влияние нейропептида ТБКУ на сохранность нейронов
в процессе криоконсервации
3.5.3. Изучение возможных криозащитных свойств ТБКУ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3. 1. Выживаемость нейронов в клеточной культуре после криоконсервации мозга с использованием ДМСО и криомикроскопия протектирующих растворов
Изучение криоконсервации изолированного мозга моллюска с использованием разных концентраций ДМСО (1М, 2М и ЗМ) показало, что лучшая сохранность нейронов обеспечивается ДМСО в концентрации 2М (рис. 2). В этом варианте эксперимента в клеточной культуре выживало 78% нейронов, изолированных из заморожено-оттаянного мозга, в то время как с использованием других концентраций ДМСО (1М и ЗМ) живыми были 38% и 3% нейронов, соответственно (р < 0.001).

контроль 1М 2 М 3 М
Рис. 2. Зависимость количества живых нейронов в культуре, выделенных из мозга после крноконсервации, от концентрации ДМСО, % * - достоверная разница между числом живых нейронов в контроле и после криоконсервации мозга моллюска с разными концентрациями ДМСО, р < 0.001.
Известно, что сохранность клеток при замораживании и хранении в жидком азоте в первую очередь зависит от механических повреждений, связанных с характером кристаллизации, а также с размерами и формой микрочастиц льда (МКЧЛ). Крупные кристаллы и МКЧЛ, имеющие формы с острыми углами, как правило, являются причиной механических повреждений клеток. Одно из основных свойств криопротекторов - это изменение характера кристаллизации растворов. Криомикроскопический