Молекулярные механизмы действия белков FtsZ, виллина и системы рестрикции-модификации Esp13961, исследованные флуоресцентными методами

• Автор: Сабанцев, Антон Владимирович
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 110 с. : ил.

Оглавление
1. Введение
2. Обзор литературы
2.1. Стохастичность экспрессии генов и системы рестрикции-
модификации
2.2. Локализационная микроскопия
2.3. Методы преодоления дрейфа образца для ЛМ
2.4. FtsZ - один из ключевых белков цитокинеза бактерий
2.5. Механизм переключения активности актин-связывающего белка
виллина
3. Материалы и методы
3.1. Исследование стохастичности экспрессии МТ и ЭР СРМ
Espl396I.
3.2. Стабилизация положения объекта для локализационной
микроскопии
3.3. Локализационная микроскопия FtsZ в клетках E. coli
3.4. Исследование взаимодействия домена 6 виллина с кальцием
4. Результаты и обсуждение
4.1. Распределения клеток E. coli по концентрации ЭР и МТ СРМ
Espl396I.
4.2. Анализ внутриклеточного распределения МТ и ЭР
4.3. Разработка протокола наблюдения «пробоя» СРМ на уровне
одиночных клеток
4.4. Разработка системы стабилизации положения объекта для ЛМ.
4.5. Структуры, формируемые белком FtsZ в клетках E. coli
4.6. Связывание домена 6 виллина с кальцием
5. Выводы
6. Список сокращений
7. Список публикаций по теме диссертации
8. Список литературы
1. Введение
Актуальность проблемы. Стохастичность процесса экспрессии генов, а также случайные флуктуации концентраций различных веществ в клетке, приводят к тому, что даже в генетически однородной популяции микроорганизмов наблюдаются существенные фенотипические различия, обусловленные различиями в количествах различных белков в отдельных клетках [33]. Важность этого факта была в полной мере осознана лишь недавно, когда было показано, что стохастичность экспрессии генов играет существенную роль в эволюции микроорганизмов, преодолении стрессов, выборе литического или лизогенного пути развития бактериофагом и других процессах [49 , 97].
Важную роль в биологии бактерий играют системы рестрикции-модификации (СРМ), которые представляют собой набор ферментов, обычно кодируемых мобильным генетическим элементом, обеспечивающих защиту клетки от чужеродной ДНК, в том числе бактериофагов [127]. Действие СРМ основано на активности двух ферментов: метилтрансферазы (МТ) и
эндонуклеазы рестрикции (ЭР). Ферментативная активность ЭР заключается во внесении двунитевого разрыва по определенному сайту в ДНК. МТ в свою очередь осуществляет метилирование оснований ДНК по этому же сайту, тем самым предотвращая разрезание ДНК по этому сайту ЭР. Несмотря на высокую эффективность, СРМ не обеспечивает абсолютной защиты от бактериофага и небольшая доля бактериофагов метилируется и дает начало устойчивому к СРМ потомству. В работе [34] проведен подробный теоретический анализ возможных механизмов преодоления бактериофагом СРМ, который показал, что преодооение СРМ бактериофагом может быть связано со стохастичностью процесса рестрикции/метилирования ДНК бактериофага и со стохастическими вариациями концентраций ЭР и МТ от клетки к клетке. Для проверки этих гипотез было решено проанализировать стохастичность экспрессии геном ЭР и

[37]. В работе [77] при помощи флуоресцентной микроскопии клеток, экспрессирующих белок слияния FtsZ с GFP, кодируемый плазмидой, было показано, что FtsZ формирует спиралевидные структуры с шагом около 200 нм (изображения получены методом деконволюции) в некоторых клетках E. coli, как в присутствие (рис. 2.4.1, Е), так и в отсутствие Z-кольца (рис. 2.4.2, C-D).

А ВС
• * • ч • % V * л* г% V Г

D Е F
Рис. 2.4.1. Локализация FtsZ-GFP в клетках E.coli [77].
Кроме того, в филаментных клетках, присутствующих в нормальной культуре, были обнаружены спиралевидные структуры с периодом около 500 нм (рис. 2.4.2, Е) и регулярно расположенные на расстоянии около 300 нм фокусы (рис. 2.4.2, Р). Однако экспрессия флуоресцентно-меченого РГБг в дополнение к нативному белку могла исказить формируемые этими белками структуры.