Разработка методов иммуноанализа с использованием магнитных наномаркеров

• Автор: Орлов, Алексей Владимирович
• Шифр специальности: 03.01.02, 03.01.08
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 131 с. : ил.

Оглавление
Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Антитела в иммуноанализе

1.2. Типы и форматы иммуноанализа

1.3. Основные количественные характеристики иммуноанализа

1.4. Методы изучения межмолекулярных взаимодействий

1.5. Твердофазный иммуноферментный анализ

1.6. Иммунохроматографический анализ

1.7. Иммуноанализ с использованием технологии микрочипов

1.8. Основные методы детекции, применяемые в иммуноанализе

1.9. Использование магнитных частиц в иммуноанализе
1.10. Свойства магнитных частиц
1.11. Методы детекции магнитных частиц
Глава 2. Разработка и верификация метода изучения взаимодействий между биомолекулами в режиме реального времени с помощью спектральнокорреляционной интерферометрии
2.1. Материалы и методы
2.2. Результаты исследования обратимых изменений толщины сополимеров 14,Ы-диметилакрил амида и 14-акрилоил-т-аминофенилборной кислоты
2.3. Влияние пептидного фрагмента (65-76) С-концевого домена моноцитарного хемотаксического белка-1 (МСР-1) на взаимодействие МСР-1 с гепарином
Глава 3. Количественный мониторинг каждой стадии иммуноанализа с помощью метода СКИ и амплификация СКИ-сигнала за счет использования магнитных наночастиц
3.1. Материалы и методы
3.2. Оптимизация процесса иммобилизации антител
3.3. Кинетическая характеризация каждой стадии иммуноанализа
Глава 4. Разработка метода магнитного иммуноанализа на поверхности непрозрачных волоконных фильтров для детекции стафилококковых токсинов в цельном молоке
4.1. Материалы и методы
4.2. Характеризация твердой фазы
4.3. Изучение аналитических свойств метода
4.4. Исследование возможности увеличения объема пробы
Глава 5. Разработка иммунохроматографического экспресс-анализа с использованием магнитных наномаркеров для детекции онкомаркера ПСА в сыворотке крови человека
5.1. Материалы и методы
5.2. Оптимизация условий магнитной иммунохроматографии
5.3. Изучение аналитических характеристик магнитной
иммунохроматографии
Результаты и выводы
Благодарности
Список используемых сокращений
Список использованной литературы
Введение
Актуальность проблемы
В последние годы значительное внимание исследователей во всем мире уделяется разработке биофизических методов для высокочувствительной количественной регистрации биомолекул и их взаимодействий между собой. В частности, высокая востребованность со стороны таких отраслей, как фармацевтическая промышленность, медицинская диагностика, экологический мониторинг и др., диктует необходимость разработки точных и скоростных методов обнаружения белковых молекул в биологических образцах сложного состава (кровь, сыворотка, слюна, молоко и т.д.). Исследования в данном направлении требуют междисциплинарного подхода и чрезвычайно важны, поскольку их результаты могут использоваться для решения широкого круга научных и прикладных задач.
Одним из наиболее популярных методов детекции биомолекул является иммуноанализ. Традиционные количественные методы иммуноанализа, такие как иммуноферментный анализ, характеризуются длительным временем получения результата (не менее 2 ч). Относительно быстрые методы, позволяющие получить результат в течение 10 мин, например иммунохроматографический анализ, как правило, дают только качественную оценку в терминах "да/нет".
Перспективным подходом для увеличения чувствительности и сокращения времени иммуноанализа является использование магнитных наночастиц (МЧ) в качестве детектируемых меток. Одним из преимуществ таких меток является возможность их использования в непрозрачных или сильно рассеивающих средах, например, в сочетании с трехмерными твердыми фазами, где применение традиционных окрашенных, флуоресцентных и ферментных маркеров сильно ограничено.
Выбор метода детекции применяемых меток - один из факторов, оказывающих существенное влияние на эффективность иммуноанализа. Методы регистрации МЧ на основе гигантского магнитного сопротивления (ГМС), как

специальной обработке, а затем закрепленных на подложке таким образом, чтобы зоны перекрывались (рисунок 1.15). Как и другие методы иммуноанализа, ИХА может выполняться в конкурентном и сэндвич- форматах.
Рисунок 1.15. Схема иммунохроматографической тест-полоски
При проведении ИХА одна или несколько капель анализируемого образца наносится на тест в соответствующую зону. За счет капиллярных сил происходит миграция раствора по тест-полоске в зону конъюгации. На данной зоне предварительно нанесенный конъюгат связывается с антигеном из раствора (в случае проведения ИХА в сэндвич-формате). Конъюгат представляет собой частицы (например, золотые, латексные или магнитные наночастицы), на поверхности которых иммобилизованы антитела, специфически распознающие регистрируемый антиген. После этого происходит миграция в следующую зону, представляющую собой аналитическую мембрану, чаще всего изготовленную из нитроцеллюлозы. На аналитической мембране обычно находятся две линии -тестовая и контрольная. На тестовой линии иммобилизованы антитела, взаимодействующие с другим эпитопом того же антигена. На контрольной линии иммобилизованы антитела, распознающие антитела на частице. Как правило, на контрольной линии размещают антивидовые антитела. В процессе миграции тестируемого раствора по аналитический мембране происходит связывание