Анализ структурно-функциональных свойств комплексов белка вирулентности агробактерий VirE2

• Автор: Мазилов, Святослав Игоревич
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 138 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений и обозначений

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Мембранный транспорт

1.1.1 Простая диффузия

1.1.2 Транспорт, обусловленный белками

1.1.2.1 Белковые поры

1.1.2.1.1 Складочные трансмембранные структуры

1.1.2.1.2 Спиральные трансмембранные структуры

1.1.2.1.3 Т1М-бочки (К+-канал)
1.1.2.2 Белки переносчики
1.1.2.3 Активный транспорт
1.1.3 Транспорт крупных молекул и частиц
1.1.3.1 Эндоцитоз
1.1.3.2 Экзоцитоз
1.2 Ядерные поры
1.3 Горизонтальный перенос генов
1.4 Горизонтальный перенос генов с участием агробактерий
1.4.1 Перенос ДНК через мембраны растительной клетки
1.4.2 Роль ЛгЕ2-белка в переносе Т-ДНК агробактериями
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Использованные приборы и материалы
2.1.1 Реагенты
2.1.2 Материалы
2.1.3 Среды
2.1.4 Состав буферов
2.1.5 Использованные штаммы и плазмиды
2.1.6 Культуры животных клеток

2.1.7 Растительный материал
2.1.8 Приборы и аппаратура:
2.2 Выделение белка VirE2
2.3 Определение размеров белков методом динамического лазерного
рассеяния света
2.4 Получение оцДНК
2.5 Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ) Т-комплекса
2.6 Исследование взаимодействия белка VirE2 с липидной мембраной
2.7 Получение липосом
2.8 Измерение флуоресценции эукариотических клеткок после инкубации
с белком VirE2 и олигонуклеотидами
2.9 Использованные базы данных
2.9.1 GenBank
2.9.2 RefSeq
2.9.3 EMBL
2.9.4 DDBJ
2.9.5 PIR
2.9.6 UniProt
2.9.7 PDB
2.9.8 Pfam
2.10 Использованные белковые структуры
2.11 Использованные компьютерные программы
2.11.1 BLAST
2.11.2 PROFsec (PredictProtein)
2.11.3 Phyre
2.11.4 Swiss-PdbViewer (Deep View)
2.11.5 MEMSAT (P SIPRED)
2.11.6 GRAMM-X
2.11.7 Hex Protein Docking
2.11.8 Membrane Builder (CHARMM-GUI)
2.11.9 MOLEOnline
2.12 Статистическая обработка данных
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Компьютерный поиск гомологов белка VirE2
3.2 Компьютерное моделирование и анализ вторичной структуры
- - белка V irE2
3.3 Измерение размера белка VirE2 методом динамического рассеяния
света
3.4 Измерение комплексов из белков VirE2 и одноцепочечной ДНК методом динамического рассеяния света
3.5 Измерение комплексов из белков VirE2 и одноцепочечной ДНК
методом трансмиссионной электронной микроскопии
3.6 Экспериментальное исследование взаимодействия VirE2
с липосомами
3.7 Компьютерная оценка комплекса из двух белков VirE2, построенного
с помощью программы Нех
3.8 Компьютерная оценка размера комплекса из двух белков VirE2,
построенного с помощью программы GRAMM-X
3.9 Компьютерная оценка размера комплекса из четырёх белков VirE2,
построенного с помощью программы GRAMM-X
3.10 Компьютерный поиск трансмембранных участков
3.11 Компьютерное моделирование положения в мембране комплексов из двух и четырёх белков VirE2
3.12 Компьютерный анализ туннельных структур, образуемых
белком VirE2
3.13 Экспериментальное исследование взаимодействия VirE2 с плоской липидной мембраной
3.14 Экспериментальная оценка интенсивности флуоресценции корневых волосков пшеницы при добавлении меченых олигонуклеотидов и белка VirE2

A. rhizogenes, A. rubi, A. vinis) и сапрофитные (A. radiobacter) представители. Агробактерии - почвенные аэробные грамотрицательные подвижные палочки с перитрихиальными жгутиками. Патогенные виды Agrobacterium вызывают развитие недифференцированных опухолей у двудольных и однодольных растений. Фитопатогенность агробактерий обусловлена наличием онкогенных плазмид (Zaenen et al., 1974 - Ti (tumor inducing) плазмиды у Agrobacterium tumefaciens и Ri (root inducing) плазмиды у Agrobacterium rhizogenes. Фрагмент Ti-плазмиды A. tumefaciens - Т-ДНК (transferred) - может переноситься из бактериальной клетки в растительную и встраиваться в ее геном. Стабильная интеграция агробактериальной Т-ДНК в растительный геном была доказана в 1977 г. (Chilton et al., 1977). В инфицированных клетках экспрессия генов Т-ДНК приводит к увеличению синтеза гормонов и, как следствие, к изменению дифференциации клеток и неуправляемой пролиферации, в результате чего развивается опухоль. Опухолевые клетки синтезируют опины - производные аминокислот и сахаров, используемых только агробактериями как источник углерода и азота (Lippincott et al., 1969). Круг растений-хозяев агробактерий очень широк и включает покрытосеменные (в основном двудольные) и голосеменные растения. Кроме того, агробактерии способны трансформировать грибы: дрожжи (Piers et al., 1983; Bundock, Hooykaas, 1996), аскомицеты и базидиомицеты (De Groot etal., 1998), шампиньоны (Mikosch et al., 2001), и даже человеческие клетки HeLa (Kunik et al., 2001).
Агробактериальная трансформация является многоступенчатым процессом и включает этапы прикрепления агробактерий к клеточной стенке или мембране растительной клетки, запуска экспрессии белков вирулентности, вырезания Т-нити, её транспортировки через мембраны бактериальной и растительной клеток и через пору ядерной мембраны, встраивания в ДНК растения.
Область вирулентности состоит из восьми оперонов (virA-virH), содержащих гены вирулентности, которые обеспечивают процесс