Молекулярная радиобиология сложного гена vestigial Drosophila melanogaster

• Автор: Афанасьева, Кристина Петровна
• Шифр специальности: 03.01.01
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Дубна
• Количество страниц: 92 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Радиационный мутагенез отдельных генов у животных и человека
1.1.1.Радиационный мутагенез в генеративных клетках высших животных
1.1.1.1.Молекулярная природа радиационно-индуцированных
«точковых» мутаций гена
1.1.1.2.Молекулярная природа радиационно-индуцированных
мутаций гена аберрационного класса
1.1.2.Радиационный мутагенез отдельных генов в соматических клетках млекопитающих
1.2. Структура трека ионизирующих излучений и первичные повреждения ДНК
1.3. Механизмы ошибочной репарации первичных повреждений ДНК
1.4. Структурная организация хроматина зрелых генеративных клеток у высших животных
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Выделение геномной ДНК
2.2. Полимеразная цепная реакция
2.3. Анализ гетеродуплексов
2.4. Секвенирование
3. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. ПЦР-анализ спонтанных мутаций
3.2. ПЦР-анализ радиационно-индуцированных «точковых» мутантов гена vg О. melanogaster

3.3. ПЦР-анализ радиационных мутантов vg с хромосомными обменами
3.4. Сравнительный анализ действия трех видов облучения на молекулярном уровне
3.5. Распределение на карте гена vg ПЦР-выявляемых повреждений
3.6. Сочетание хромосомного обмена с делецией в области аберрационного разрыва
3.7. Результаты секвенирования 3-го и 4-го экзонов у аллеля vg! и радиационных мутантов без ампликона 9 (интрон 3)
3.8. Гетеродуплексный анализ и секвенирование экзонов 3 и 4 радиационных мутантов гена vg, изученных методом ПЦР
3.9. Кластерный характер действия радиации на геном
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
Одним из концептуальных заключений классический радиационной генетики и цитогенетики явилось утверждение (Muller, 1954 а, б), что обязательными компонентами спектра изменений любого гена в генеративных клетках, индуцируемых ионизирующим излучением, являются два главных класса мутаций - «точковые» (внутригенные изменения) и аберрационные (делеционного и обменного типа).
Однако, природа «точковых» мутаций оставалась неизвестной в этот, домолекулярный, период радиационной генетики. В отношении хромосомных перестроек с местами разрыва в области гена также оставался невыясненным вопрос, локализован ли разрыв внутри гена или рядом, за его пределами и какова в таком случае природа мутантного фенотипа. При цитологической локализации аберрационного разрыва вне гена мутантный фенотип связывали с «эффектом положения», а предположение о наличии сразу двух независимых повреждений в виде «точковой» мутации гена и независимой хромосомной перестройки не подтверждалось линейной зависимостью индукции такого рода мутаций наблюдаемой в экспериментах (Дубинин, 1934).
Разделение радиационно-индуцированных мутаций гена на два класса «точковой» и аберрационной природы является актуальным и в настоящее время, что подтверждается более поздними работами, выполненными как на генеративных (Александров, 1987; Russel, 1971), так и на соматических клетках (Howard et al., 1987).
Новые молекулярные методы позволили установить достаточно широкий спектр мутационных изменений гена после действия главным образом редкоионизирующего излучения, как в генеративных, так и в соматических клетках, варьирующие от изменений на уровне отдельных

Формирование гетеродуплексов проводили в объеме 20 мкл с использованием продуктов ПЦР мутантного и контрольного генотипов в соотношении 2:1 в следующих условиях: денатурация - 98°С, 5мин., образование гетеродуплекса - 65°С, ЗОмин., с последующим
охлаждением до комнатной температуры.
Рис. 5. Результаты гетеродуплексного анализа мутантов vg77a4 и ^83с24 с микроделециями (лунки 1 и 4) и мутантов vg83ll, vg88g40 и с заменой основания (лунки 2, 3 и 5). Стрелками указаны положения гетеродуплексов ДНК у делеционных мутантов.
Тонкий, 0,8 мм толщины гель, содержащий 10%-ныйполиакриламид в соотношении 28:1 к бис-акриламиду, 10%-ный этиленгликоль, 15%-ныйформамид с добавлением ПСА и ТЕМЕД для инициации полимеризации, готовили в 0,5*ТТЕ буфере (ПТТЕ: 89 ммоль/л Трис, 28,5 ммоль/л таурин, 0,2 ммоль/л ЭДТА, pH 9.0).