Молекулярный анализ особенностей радиационного мутагенеза генов black и cinnabar Drosophila melanogaster

• Автор: Давкова, Лилиана Николаевна
• Шифр специальности: 03.01.01
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Дубна
• Количество страниц: 88 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Классический период в изучении радиационного мутагенеза высших эукариот (локус-специфический мутагенез)
1.1.1. Исследования на Drosophila melanogaster
1.1.2. Исследования на других лабораторных тест- объектах
1.2. Биофизические механизмы радиационного мутагенеза
1.2.1. Классический период исследований
1.2.2. Современные представления о структуре трека
1.3. Молекулярная природа радиационно-индуцированных генных мутаций
1.3.1. Исследования на генеративных клетках
1.3.2. Исследования на соматических клетках
1.4. Репарационные механизмы радиационного мутагенеза
1.5. Заключение
2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Радиационно-индуцированные мутации двух изучаемых генов D.melanogaster и методические особенности их получения
2.2 Общая и молекулярная генетика генов black* и сп+
D.melanogaster
2.3. Методы молекулярного анализа «толковых» мутантов двух
генов
2.3.1 Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)
2.3.2. Секвенирование ДНК гена black у «толковых» мутантов
2.4. Статистический анализ данных
3.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
3.1. Общая характеристика радиомутабильности двух генов
3.2. Результаты ПЦР-анализа
3.2.1. Мутанты black
3.2.2. Мутанты cinnabar
3.3. Результаты секвенирования «толковых» мутантов black.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ
Современные молекулярно-генетические исследования по изучению природы генных мутаций, индуцированных ионизирующими излучениями, ведутся в основном на соматических клетках in vitro или in vivo с определением мутационных изменений, главным образом, в виде делений всего или части гена методами блот-гибридизации или полимеразной цепной реакции (ПЦР) и в редких случаях методом секвенирования (UNSCEAR 2000 Report Vol. И).
Аналогичные исследования по выяснению молекулярной природы
радиационно-индуцированных генных мутаций в генеративных клетках
главных для радиационной генетики лабораторных тест-объектов (дрозофила,
мышь) остаются немногочисленными, а их результаты фрагментарны,
поскольку получены на ограниченном материале. В частности, первые
молекулярно-генетические работы с использованием метода блот-
гибридизации показали, что в основе генных мутаций, индуцированных
редко-ионизирующим излучением, как у дрозофилы (Ashbumer et. al.,1982;
Kelley et. al., 1985), так и у мыши (Rinchik et.al., 1993) лежат, в основном,
молекулярные делеции варьирующей величины. Близкие результаты
получены и для генных мутаций в опытах на дрозофиле с нейтронами, как
плотноионизирующим излучением (Pastink et.al., 1987). В то же время,
использование метода секвенирования позволило обнаружить более широкий
спектр рентген-индуцированных молекулярных изменений ДНК гена
дрозофилы, включающий наряду с делециями/инсерциями и изменения на
уровне отдельных оснований ДНК (Eeken J.C. et.al., 1994). Вопрос о характере
молекулярных изменений, выявляемых методом секвенирования при
индукции генных мутаций плотноионизирующими излучениями, в частности
нейтронами, в генеративных клетках до сих пор остается открытым. Таким
образом, ограниченность имеющихся данных для генеративных клеток
затрудняет экстраполяцию на них результатов, полученных на соматических,
и не позволяет выявить общие и специфические для двух типов клеток

для генов black и си в случае ее оценки по коэффициентам наклона соответствующих кривых доза-эффект, хотя эти различия статистически не значимы (Р>0.05). В индукции «точковых» мутаций Ыаск нейтроны также более эффективны, чем в индукции мутаций сп (коэффициенты ОГЭ 5.0 и 2.5 для этих генов соответственно) и эти различия статистически высоко значимы (Р<0.05).
Наличие имеющихся данных в протоколах опытов с у-излучением и нейтронами по летальному действию этих видов радиации (выживаемость Fi особей от яйца до имаго при разных дозах относительно контроля, принятого за 100) позволяет более точно оценить ОГЭ нейтронов в индукции основных классов мутаций двух генов в широком диапазоне выживаемости при одной и той же для двух видов радиации поглощенной дозе в 1 Гр (рис. 4). Как видно из рисунка, по тесту «все аберрационные мутации в целом (включая стерильные Fi особи)» (рис.4 а) частота таких мутантов black в широком диапазоне выживаемости практически постоянна (0.52х10'5/л/Гр и 1.37x10' 5/л/Гр в среднем по диапазону для у-квантов 60Со и нейтронов, соответственно), но при этом нейтроны заметно эффективнее фотонов 60 Со (коэффициент ОГЭ = 2.5 и при этом практически не меняется во всем изученном диапазоне выживаемости).
В случае гена сп наблюдаемые зависимости принципиально иные: со снижением выживаемости частота хромосомных мутаций сп, индуцированных у-излучением, возрастает с 0.8 до 1.2х10'5 /л/Гр при самом низком уровне выживаемости (около 4%). Эта закономерность еще более выражена после действия нейтронов, когда частота хромосомных мутаций сп возрастает в 2.0 раза (с 1.8 до 3.6х10‘5 /л/Гр) в диапазоне 73.5-^19.4% выживаемости (рис. 4а). Отсюда следует, что ОГЭ нейтронов по данному тесту возрастает с 2.0 до 4.0, если принять, что средняя частота обсуждаемых мутаций для всего диапазона выживаемости после облучения у-квантами 60Со составляет 0.88х10‘5/л/Гр.