Хроматин-зависимая модуляция экспрессии генов, контролирующих клеточный цикл, в трансформантах E1A+cHa-ras

• Автор: Абрамова, Мария Вячеславовна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 145 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ
1.1. Актуальность проблемы
1.2. Цели и задачи исследования
1.3. Основные положения, выносимые на защиту
1.4. Научная новизна
1.5. Теоретическое и практическое значение работы
1.6. Апробация работы
1.7. Объем и структура диссертации
ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Регуляция клеточного цикла
2.2. Роль МАР-киназных каскадов в контроле клеточного цикла
2.3. Транскрипционный фактор АР-
2.3.1. Основные свойства АР-
2.3.2. Роль белков АР-1 в пролиферации клеток
2.3.3. Роль белков семейства Fos в составе АР-
2.3.4. Регуляция активности АР-
2.3.5. Регуляция транскрипции генов, кодирующих АР-
2.3.5.1. Регуляция транскрипции гена с-jim
2.3.5.2. Регуляция транскрипции гена c-fos
2.4. Структура хроматина и регуляция транскрипции
2.4.1. Хроматин-модифицирующие ферменты
2.4.3. HAT и транскрипционная активация
2.4.4. HD АС и транскрипционная репрессия
2.4.5. Нарушение ацетилирования гистонов и рак
2.5. Ингибиторы HDAC
2.6. Онкогены и опухолевая трансформация клеток
2.6.1. Классификация онкогенов
2.6.3. Онкоген El А раннего района аденовируса человека и контроль клеточного цикла
2.6.3.1. Мишени Е1А - Белки семейства Rb
2.6.3.2. Мишени Е1А - циклины и циклин-зависимые киназы
2.6.3.3. Мишени EIA - HAT, HDAC и реорганизация хроматина
2.6.3.4. Мишени El А - транскрипционный комплекс АР-
2.6.4. Цитоплазматический онкоген ras. Функции белков Ras в проведении сигнала
2.6.2. Трансформация клеток
2.6.5. Трансформация онкогенами El А и сНа -ras
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Культивирование клеток

3.2. Обработка клеток ингибиторами
3.3. Анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла
3.4. Иммунопреципитация
3.5. Анализ содержания белков методом иммуноблотинга
3.6. Получение ядерных экстрактов
3.7. Фосфорилирование белков in vitro
3.8. Диск-электрофорез белков по Лэмли
3.9. RT-PCR анализ транскрипции генов
3.10. Кинирование двуцепочечного олигонуклеотида SRE в присутствие у-32Р-АТР
3.11. Задержка подвижности ДНК-белковых комплексов в геле (EMSA)
3.12. Анализ фрагментации клеточной ДНК
3.13. Флуоресцентная окраска хроматина
ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Трансформация клеток REF онкогенами El А и сНа-гау приводит к конститутивной активности МАР киназ
4.1.1. Содержание киназ ERK, JNK и р38 в трансформантах ElA+cüa-ras повышено по сравнению с клетками REF
4.1.2. Трансформанты ElA+cHa-ras характеризуются повышенным содержанием фосфорилированных форм МАР киназ
4.1.3. Активность киназ ERK и р38 повышена в трансформантах Е1А+сНа-ras
4.2. Экспрессия генов раннего ответа по-разному дерегулирована в клетках, трансформированных онкогенами El А и сНа-ras
4.3. Анализ экспрессии TCF-белков в клетках REF и ElA+cRa-ras
4.4. Транскрипционный фактор Elk-1 конститутивно фосфорилирован в трансформантах ElA+cRa-ras
4.4.1. Белок Elk-1 доминирует в составе тройных комплексов, связывающихся с областью SRE
4.4.2. Сывороточная стимуляция не увеличивает содержания тройных комплексов SRF/SRF/TCF в клетках ElA+cRa-ras
4.4.3. Анализ статуса фосфорилировання транскрипционного фактора Elk-1 в трансформантах ElA+cRa-ras
4.4.4. Анализ активности Elk 1-ассоциированных киназ
4.5. MEK/ERK-киназный каскад является доминирующим в фосфорилировании белка Elk-1 в трансформантах ElA+cRa-ras
4.6. Анализ взаимодействия белка Elk-1 с деацетилазой гистонов HDAC-1
4.7. Бутират натрия селективно активирует транскрипцию протоонкогена с-fos в трансформантах ElA+cRa-ras
4.8. Исследование регуляции клеточного цикла трансформантов ElA+cRa-ras при обработке ингибитором HDAC бутиратом натрия
4.8.1. Эффект бутирата натрия на клеточный цикл трансформантов ElA+cRa-ras
4.8.2. NaB не вызывает апоптоза в трансформантах ElA+cRa-ras

4.8.3. Анализ экспрессии регуляторов клеточного цикла в трансформантах ElA+cHa-ras, обработанных NaB
4.8.4. Анализ способности белка p21/Wafl взаимодействовать с циклин-киназными комплексами в клетках, обработанных NaB
4.8.5. Анализ активности циклин-киназных комплексов в клетках Е1А+сНа-ras, обработанных NaB
ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ
5.1. Активация МАР-киназ при трансформации онкогенами El А и сНа-ras.
5.2. Модуляция экспрессии генов раннего ответа при трансформации онкогенами El А и сНа-ras
5.3. Роль структуры хроматина в репрессии транскрипции протоонкогена c-fos в трансформантах ElA+cRa-ras
5.4. Ингибиторы HDAC и клеточный цикл трансформантов £L4+cHa-ras..
5.4.1. Ингибитор HDAC бутират натрия модулирует экспрессию генов, контролирующих клеточный цикл
5.4.2. Роль белка p21/Wafl в NaB-индуцированной остановке пролиферации трансформантов ElA+cRü-ras
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

гибридного белка AML1-ETO, который, как и в предыдущем примере, становится конститутивным репрессором транскрипции, благодаря постоянному привлечению активности HDAC (Wang et al., 1999). Эти примеры отражают очевидную роль HD АС в онкогенезе.
В примерах, приведенных выше, транскрипционная репрессия связана с привлечением активности HDAC, поэтому логично было предположить возможную пользу от специфических ингибиторов HDAC в лечении рака. Нарушение баланса ацетилирования гистонов может привести к изменениям в структуре хроматина и нарушению регуляции транскрипции генов, вовлеченных в контроль клеточного цикла, дифференцировки и/или апоптоза.
2.5. Ингибиторы HDAC.
В настоящее время идентифицировано несколько классов веществ, обладающих способностью ингибировать активность HD АС: жирные кислоты с короткими цепочками (такие как бутират, 4-фенилбутират и вальпроевая кислота); гидроксамовые кислоты (такие как SAHA (suberoylanilide hydroxamic asid), трихостатин A, CHAP , пироксамид и оксамфлацин); циклические тетрапептиды (трапоксин, апицидин и депсипептид) и бензамиды (MS-275). По данным кристаллографического анализа ингибиторы HDAC на основе гидроксамовых кислот взаимодействуют с каталитической областью HDAC, блокируя тем самым доступ субстрата к иону цинка в активном центре фермента (Finnin et al., 1999). Исследование структуры и активности ингибиторов HDAC на основе жирных кислот с короткими цепями пока не дало ответа о механизме действия. Однако их применение в ингибировании активности HDAC in vitro и в клинических испытаниях доказывает их эффективность. Другие классы ингибиторов HDAC эффективно связываются с каталитической областью HDAC и являются более специфическими ингибиторами деацетилазной активности в достаточно низких концентрациях (от микромолей до, менее чем наномолей) (Marks et al., 2000).
Изучение активности ингибиторов HDAC показало, что они вызывают остановку пролиферации в фазах G1 и/или G2, апоптоз и/или дифференцировку в культуре трансформированных клеток. Причем круг