Влияние агробактериальных генов rolA, rolB и rolC на устойчивость к абиотическим факторам и биосинтез антрахинонов в трансгенных культурах Rubia cordifolia L.

• Автор: Веремейчик, Галина Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 111 с. : ил.

СОДЕРДЖАНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Общая характеристика марены сердцелистной (Rubia cordifolia)
1.2. Агробактериальная индукция онкогенеза у растений
1.3. Агробактериальные гены rol — растительные онкогены
1.4. Активные формы кислорода, их роль в защитных реакциях растений
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Объект исследования

2.2. Получение и культивирование клеточных культур марены
2.3. Выделение плазмидной ДНК
2.4. Выделение тотальной растительной ДНК
2.5. Выделение тотальной растительной РНК
2.6. Реакция обратной транскрипции
и получение амплифицироваиной кДНК
2.7. Доказательство трансгенности полученных культур
2.8. Доказательство экспрессии генов rol в трансгенных культурах
2.9. Анализ экспрессии гена изохоризматсинтазы (ICS)
2.10. Анализ экспрессии генов кальцийзависимых протеинкиназ (CDPK)
2.11. Анализ экспрессии генов НАДФН-оксидаз (Rboli)
2.12. Методы оценки уровня экспрессии генов
2.13. Секвенирование и анализ последовательностей
2.14. Химический анализ антрахинонов
2.15. Измерение концентрации внутриклеточного кальция
2.16. Измерение внутриклеточной концентрации активных форм кислорода
2.17. Флуорпметрическое измерение активных форм кислорода
2.18. Масс-спектрометричсский анализ
содержания салициловой кислоты
2.19. Статистический анализ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
4.1 Индивидуальное и совместное действие генов roi
в трансгенных культурах марены сердцелистной
4.2. Влияние генов roi на содержание активных форм
кислорода в трансгенных клетках марены сердцелистной
4.3. Воздействие абиотических факторов на
rol-экспрессирующие культуры марены сердцелистной
4.4. Воздействие гена ro/С на НАДФН-оксидазную сигнальную
систему в ro/C-культурах марены сердцелистной
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
2,4-Д — 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (растительный гормон роста),
АНУ — а-нафтилуксусная кислота (растительный гормон роста), а.о. — аминокислотный остаток,
АФК — активные формы кислорода,
АХ — антрахиноны (класс хинонов),
БАП — 6-бензиламинопурин (растительный гормон роста), п.н. — пара нуклеотидов,
ОЕФ — относительные единицы флюоресценции,
ПЦР — полимеразная цепная реакция,
С.О. — стандартная ошибка значений,
СОД — супероксидднсмутаза
ЭДТА — этилендиамин тетрауксусная кислота,
МАР — митоген-активыруемые белки (семейство протеинкиназ),
РЛ-белки — патоген-обусловленные белки,
Л — нетрансформированная (контрольная) культура КиЫа согсИ/оНа,
ЛА — трансформированная культура ЯиЫа согсИ/оНа, содержащая ген го1А,
ЛВ-Ь — го/В-трансгенная культуры КиЫа согсН/оПа с низкой экспрессией трансгена, ЛВ-М — го/В-трансгенная культуры КиЫа согсН/оПа со средней экспрессией трансгена, ЛВ-Н — го/В-трансгенная культуры КиЫа согеИ/оИа с высокой экспрессией трансгена, ЛС-Ь — го1С-трансгенная культуры КиЫа согсИ[оИа с низкой экспрессией трансгена, ЛС-М — го/С-трансгенная культуры КиЫа согсН/оПа со средней экспрессией трансгена, ЛС-Н — го/С-трансгенная культуры КиЫа согсИ/оИа с высокой экспрессии! трансгена, Л-АВС — трансформированная культура КиЫа согсИ/оИа, содержащая ген го!АВС,
ЛА4 — трансгенная культура КиЫа согсИ/оИа, трансформированная диким штаммом А. rЫzogenes А4
ТАЕ — буфер на основе Трис-НС1 и уксусной кислоты, с добавлением ЭДТА

аллостерические свойства ферментов, а также устанавливать порог активации (Hong et al., 1996). О функции N-терминального вариабельного домена достоверно практически ничего неизвестно (Cheng et al., 2002).
Среди многих форм CDPK, чьи функции достоверно известны, формы StCDPK4 и StCDPK5 картофеля и гомологичные им формы из других видов растений активируют посредством фосфорилирования НАДФН-оксидазу. При этом, как упоминалось ранее, для подобной активации подходят определенные формы Rboh, на N-терминальном конце которых присутствует универсальный мотив узнавания для CDPK. В исследованиях Kobayashi было показано, что в НАДФН-оксидазной сигнальной системы картофеля активность патоген-индуцируемых форм StRBOHB и StRBOHD регулируется посредством StCDPK4 и StCDPK5 (Kobayashi et al., 2007) (рис. 8.).
Рис. 8. Схема регуляции активности НАДФН-оксидазы картофеля.
СБРК — кальцийзависимая протеинкиназа картофеля 81СПРК5; Юзой — НАДФН-оксидаз картофеля БИШОНБ; ЕР — Са2+-связывающий домен; Р — мотив для фосфорилирования кальцийзависимой протеинкиназой (по: КоЬауаяЫ ег а1, 2007).