Исследование прионных свойств белка PrP в дрожжах Saccharomyces cerevisiae

• Автор: Рубель, Александр Анатольевич
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 167 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Список сокращений
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Прионы млекопитающих
1.1.1. История открытия прионов и прионная концепция
1.1.2. Экспериментальные данные, подтверждающие прионную
концепцию
1.1.3. Механизм прионизации
1.1.4. Структурные особенности и функции белка РгР
1.1.5. Формы прионных заболеваний
1.1.6. Штаммы PrPSc
1.1.7. Механизмы транспорта PrPSc
1.1.8. Механизм, лежащий в основе нейродегенерации
1.1.9. Детекция прионных заболеваний на ранних стадиях
1.1.10. Подходы к терапии и потенциальные лекарства от прионных
болезней
1.2. Прионоподобные факторы низших эукариот
1.2.1. Белок Ure2 - Фактор [URE3]
1.2.2. Белок Sup35 - фактор [РбУ]
1.2.3. Структурные особенности прион-формирующих доменов
дрожжевых прионов
1.2.4. Фактор [Р/У] и взаимодействие прионов
1.2.5. Варианты дрожжевых прионов
1.2.6. Влияние шаперонов и других белков на дрожжевые прионы
1.3. Дрожжи как модель для исследования амилоидозов млекопитающих
2. Материалы и методы
2.1. Штаммы и плазмиды, использованные в работе

2.1.1. Штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae и бактерии Escherichia
coli
2.1.2. Плазмиды
2.2. Среды и условия культивирования
2.3. Генетические методы
2.4. Молекулярно-биологические методы
2.5. Выделение белка из дрожжей
2.6. Дифференциальное центрифугирование
2.7. Анализ устойчивости белков к действию протеиназы-К
2.8. Белковый электрофорез и «Вестерн-блот» гибридизация
2.9. Флуоресцентная микроскопия
2.9.1. Метод флуоресцентного анализа агрегатов PrP-GFP
2.9.2. Окраска компартментов дрожжевой клетки флуоресцентными красителями
2.9.3. Восстановление флуоресценции после фотовыжигания (FRAP)
2.10. Анализ токсичности агрегатов PrP-GFP
2.11. Статистическая обработка результатов
3. Результаты
3.1. Анализ агрегации белков РгР и PrP-GFP в дрожжах
3.1.1. Биохимический анализ агрегатов белков PrP(23-231) и PrP-GFP
3.1.2. Цитологическая характеристика агрегатов белка PrP-GFP
3.1.3. Расчет доли мобильной фракции (Mf) для агрегатов PrP-GFP
3.1.4. Анализ токсичности агрегатов белка PrP-GFP
3.2.1. Конструирование дрожжевого штамма, продуцирующего химерный белок PrP-Sup35MC, на фоне делеции хромосомной копии гена SUP35
3.2.2. Анализ эффектов продукции химерного белка PrP-Sup35MC в
дрожжах S. cerevisiae
3.2.3

3.2.4. Влияние сверхпродукции белков РгР и PrP-GFP на агрегацию РгР-Sup35MC
3.2.5. Характер наследования фактора [PrPs' ] в мейозе и возможность его
передачи путём цитодукции
3.3. Эффекты дрожжевого шаперона Hspl04 на РгР-опосредованную агрегацию в дрожжах
3.3.1. Влияние сверхпродукции и инактивации дрожжевого шаперона Hsp 104 на фактор [РгР* ]
3.3.2. Эффекты шаперона Hsp 104 на агрегацию белков РгР и PrP-GFP в
дрожжах
4. Обсуждение
4.1. Характеристика агрегатов белков РгР и PrP-GFP
4.2. Биохимический и фенотипический анализ агрегации и характер наследования PrP-Sup35MC в дрожжах S. cerevisiae
4.3. Новая функция шаперона Hsp
Заключение
Выводы
Благодарности
Список литерату ры
крови больных (Castilla et al., 2005). Используя РМСА-технологию можно
также выявлять вещества, которые блокируют или стимулируют конверсию и

агрегацию PrP in vitro. В частности, таким образом было обнаружено, что определенные фракции молекул РНК, а также ионы марганца и меди, способствуют конверсии РгРс в PrPSc (Deleault et al., 2003; Kim et al., 2005).
1.1.10. Подходы к терапии и потенциальные лекарства от прионных
болезней
Поиски потенциальных лекарственных средств от прионных болезней продолжаются уже более 20-ти лет, однако на данный момент эффективных лекарств не найдено (Weissmann and Aguzzi, 2005). За последние годы разработано несколько систем тестирования веществ на антиприонную активность. В их основе лежит свойство необычайной протеазоустойчивости PrPSc: после обработки протеиназой-К отсутствие или присутствие
протеазоустойчивого фрагмента PrP(90-231), детектируемое с помощью иммунологических методов, показывает, был ли белок в нормальной конформации РгРс, или в протеазоустойчивой патогенной изоформе PrPSc. Подобные опыты проводятся на культурах хронически инфицированных клеток и на животных (в основном, на грызунах) (Korth et al., 2001; по: Bach et al., 2003). В опытах на животных также тестируют вещества на способность увеличивать продолжительность инкубационного периода (ИП) инфекции: после интрацеребрального или интраперитонеалыгого введения гомогената из мозга больного животного здоровым, опытную группу подвергают лечению тестируемым веществом, а спустя некоторое время сравнивают продолжительность инкубационного периода инфекции в опыте и контроле. Также на антиприонную активность можно тестировать вещества in vitro (см. раздел 1.1.9).
Основная цель поиска - вещество, которое излечивает болезнь после появления клинических симптомов (Caughey et al., 2006). Оно должно