Прикладные аспекты структурной и функциональной геномики растений (на примере родов Vicia L. и Hordeum L.)

• Автор: Потокина, Елена Кирилловна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 324 с. : ил.

Оглавление

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. СТРАТЕГИЯ И МЕТОДЫ ГЕНОМНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ГЕНЕТИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ РАСТЕНИЙ (обзор литературы)
1.1. Значение генетических ресурсов растений для процесса устойчивого развития сельского хозяйства
1.2. Полиморфизм нуклеотидной последовательности молекул ДНК как источник генетического разнообразия растений и методы его
анализа
1.3. Использование молекулярных маркеров в работе с коллекциями генетических ресурсов растений
1.4. Использование молекулярных маркеров в генетике и селекции
1.5. Методы функциональной геномики для анализа изменчивости агрономических
признаков
Заключение к главе
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ, ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПРОЦЕДУРЫ И СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ДАННЫХ
2.1. Объекты исследований
2.2. Экспериментальные процедуры
2.3. Статистический анализ данных
Экспериментальная часть ГЛАВА 3. СТРАТЕГИЯ МОЛЕКУЛЯРНОГО МАРКИРОВАНИЯ ПРИ РЕШЕНИИ ЗАДАЧ ПРИКЛАДНОЙ БОТАНИКИ И ОПТИМИЗАЦИИ КОЛЛЕКЦИЙ EX SITU {НА ПРИМЕРЕ VICIA L)
3.1. Филогенетическая система Vicia subgenus Vicia и перспективы межвидовой гибридизации у вик по результатам молекулярного маркирования геномов
3.2. Внутривидовое разнообразие Viciafaba L. и вопрос о происхождении возделываемых
бобов по результатам RAPD анализа
3.3. Генетический анализ мирового разнообразия посевной вики (Vicia sativa L.) методом AFLP и коэффициенты генетической оригинальности образцов коллекций генбанков по
результатам молекулярного маркирования
Заключение к главе

ГЛАВА 4. СОЗДАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БАЗЫ ДЛЯ ТРАНСКРИПТОМНОГО АНАЛИЗА ЯЧМЕНЯ
4.1. Создание библиотек кодирующих последовательностей (кДНК)
4.2. Динамика экспрессии генов в процессе прорастания семени по результатам транскринтомного анализа
4.3. Функциональная классификация дифференциально-экспрессируемых генов
Заключение к главе
ГЛАВА 5. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНОВ, ДЕТЕРМИНИРУЮЩИХ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ХОЗЯЙСТВЕННО-ЦЕННЫХ ПРИЗНАКОВ, НА ОСНОВЕ ТРАНСКРИПТОМНОГО АНАЛИЗА
5.1. Выявление корреляции между экспрессионными профилями EST и профилем варьирования фенотипического признака на примере параметров солодования у ячменя
5.2. Процедура верификации генов-кандидатов, определяющих признаки пивоваренного качества у ячменя
5.3. Возможные функции генов-кандидатов в процессах солодования
5.4. Идентификация геномных локусов, регулирующих экспрессию
генов-кандидатов на примере гена Схр
Заключение к главе
ГЛАВА 6. СОПРЯЖЕННОЕ КАРТИРОВАНИЕ ГЕНОВ И РЕГУЛЯТОРОВ ИХ ТРАНСКРИПЦИИ С ПОМОЩЬЮ О ЛИГОНУКЛЕОТИДНОГО МИКРОЧИПА AFFYMETRIX
6.1. Концепция и дизайн олигонуклеотидного микрочипа Affymetrix
6.2. Принцип генотипирования сегрегантов картирующих популяций с помощью олигонуклеотидных микрочипов Affymetrix
6.3. Картирование регуляторов транскрипции (eQTL) генома ячменя с помощью микрочипа Affymetrix 22К Barleyl GeneChip
6.4. Ограниченная плейотропия цис-регуляторных мутаций ячменя
Заключение к главе
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
ПРИЛОЖЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ
Нуклеотидные вставки, делении, а также нуклеотидные замены определяют разнообразие аллелей большинства генов. В этой связи главным объектом исследований генетики и прикладной ботаники становится разнообразие генетических ресурсов растений, выявляемое на уровне ДНК. Полиморфизм ДНК в масштабе целого генома можно изучать, опираясь на информацию о нуклеотидной последовательности всей геномной ДНК (полное секвенирование геномов) или, используя альтернативную технологию молекулярного маркирования.
В большинстве случаев молекулярные маркеры, используемые для анализа внутривидового и межвидового разнообразия у растений (RFLP, RAPD, AFLP, SSR), представляют собой анонимные ДНК-фрагменты, отражающие полиморфизм участков генома, выбранных случайным образом (Varshney et al., 2004). Репрезентативное количество идентифицированных с их помощью полиморфных геномных локусов и относительная простота лабораторных процедур позволяют эффективно использовать эти маркеры при оценке геномного сходства близкородственных таксонов культивируемых видов и решении вопросов таксономии. В настоящей работе возможности методов молекулярного маркирования при решении спорных вопросов систематики культурных растений и оптимизации коллекций генных банков проанализированы на примере видов Vicia L., представляющих практический интерес как кормовые травы и зернобобовые культуры.
Для целей прикладной генетики и селекции более эффективным является использование не анонимных, а функциональных молекулярных маркеров, которые идентифицируют полиморфизм в транскрибируемых кодирующих последовательностях ДНК - генах (Andersen, Lübberstedt, 2003). Базовым ресурсом для исследований функциональной геномики являются коллекции EST (Expressed Sequence Tags), представляющие собой секвенированные неполные копии генов, точнее фрагменты кодирующих последовательностей ДНК длиной 500-700 н.п. (Сойфер, 2000). Создание коллекций EST обусловило также развитие чип-технологий, основной задачей которых является сравнительный мониторинг уровня генных транскриптов в экспериментальных образцах. Анализ экспрессии генов с использованием чип-технологий, называют также транскриптомным анализом. По аналогии с геномом, подразумевающим совокупность всех генов организма, говоря о транскриптоме, имеют ввиду совокупность всех генов, которые транскрибируются в данной ткани, на данном этапе развития организма (Spellman et al., 1998). Потенциальное значение транскриптомного анализа для генетикоселекционных исследований очевидно: транскрипция генов является ключевым этапом
устойчивости, но сохраняющие во всех остальных локусах генома аллели Steptoe. Из растений потомства, максимально удовлетворяющих такому критерию, были получены двойные гаплоиды (с целью гомозиготизации отобранных генотипов) и на их основе создан новый сорт Танго. Новый сорт сочетал все элитные качества североамериканского сорта-стандарта Steptoe, но дополнительно отличался устойчивостью к вирусу штриховатой мозаики, которой Steptoe не обладал.
На сегодняшний день маркерная помощь отбору используется преимущественно в селекции на устойчивость к болезням. В частности, у ячменя разработан микросателлитный (SSR) маркер, сцепленный с генами устойчивости к вирусу желтой мозаики rym4 и rym5 (Graner et al., 1999), позволяющий с помощью простой ПЦР-реакции распознать устойчивые и поражаемые вирусом генотипы ячменя. Скрининг таким маркером более 100 образцов ячменя с известной фенотипической реакцией на вирус показал 100-процентную достоверность такого маркерного метода диагностики (Thomas, 2003). Клонирование гена устойчивости ячменя к стеблевой ржавчине (Brueggeman et al., 2002), показало, что восприимчивые к заболеванию генотипы ячменя характеризуются трехнуклеотидной вставкой (GTT) в последовательности гена Rpgl, которая отсутствует у 95% генотипов, устойчивых к стеблевой ржавчине. На основе этой вставки/делеции трех нуклеотидов Eckstein et al. (2005) разработали аллель-специфичный SCAR-маркер (Sequence Characterized Amplified Region), позволяющий различить устойчивые и неустойчивые генотипы ячменя с помощью ПЦР-реакции. Анализ 41 образца ячменя с известной фенотипической реакцией на заражение вирусом показал, что только в одном случае из 41 диагностика устойчивости с помощью аллель-специфичного SCAR-маркера оказалась ошибочной.
Использование маркеров в селеционном процессе имеет много ограничений, в том
числе из-за несоответствия расстояний на генетической и физической картах генома (Thomas,
2003). Маркер может быть генетически сцепленным с анализируемым признаком не по
причине их близкого расположения на хромосоме, а потому, что рекомбинация в данном
участке генома ограничена в силу каких-либо иных причин. Так, частота рекомбинаций в
районе центромеры всегда ниже, чем в теломерах хромосомы (Kunzel et al., 2000). С другой
стороны, разработка маркеров для селекции количественных признаков (QTL) сопряжена с
проблемой слишком большого доверительного интервала QTL, в пределах которого
размещается генетический локус, определяющий варьирование признака. Этот интервал
может достигать 20 сМ (Kearsey, Farquhar, 1998) и вмещать сотни генов. В таких случаях
классическими методами картирования QTL становится практически невозможно