Роль внеклеточной ДНК и липидов матрикса во взаимодействии бактерий биопленок с антибиотиками

• Автор: Тец, Георгий Викторович
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Количество страниц: 163 с.

Список сокращений:
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ДНКаза - дезоксирибонуклеаза
кДа - килодальтон
КОЕ - колониеобразующие единица
МПК - минимальная подавляющая концентрация
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РНК — рибонуклеиновая кислота
РНКаза - рибонуклеаза
Атр - ампициллин
Кт - канамицин
Те1 - тетрациклин

Список сокращений
Глава 1 Микробные сообщества. Обзор проблемы
1.1 Микробные сообщества
1.1.1 Биопленки
1.1.2 Колонии
1.1.3 Газон
1.1.4 Колониеподобные сообщества
1.1.5 Смешанные микробные сообщества
1.1.6 Смешанный газон
1.2 Регуляция свойств бактериальных биопленок
1.3 Взаимодействие микробных сообществ с факторами
окружающей среды
1.4 Внеклеточная ДНК
Глава 2 Материалы и методы
2.1 Микроорганизмы
2.2 Питательные среды
2.3 Антибиотики
2.4 Ферментные препараты
2.5 Методы
2.5.1 Получение моно-, ди- и олигонуклеотидов
2.5.2 Определение жизнеспособности бактерий
2.5.3 Определение минимальной подавляющей
концентрации антибиотиков
2.5.4 Получение бактериальных биопленок в стекляшшх
флаконах
2.5.5 Получение бактериальных биопленок в чашках
Петри
2.5.6 Получение бактериальных биопленок в пластиковых планшетах
2.5.7 Получение внеклеточного матрикса бактериальных сообществ
2.5.8 Выявление мутантов устойчивых к антибиотикам
2.5.9 Выявление передачи генов антибиотикоустойчивости
2.5.10 Выживание антибиотикоустойчивых клонов
в присутствии ДНКазы
2.5.11 Методы выделения нуклеиновых кислот
2.5.12 Электрофорез в агарозном геле
2.5.13 Выделение ДНК из бактериальных клеток
2.5.14 Извлечение ДНК из агарозного геля
2.5.15 Измерение оптической плотности матрикса
2.5.16 Оценка появления ДНК в матриксе и целостности клеточных мембран
2.5.17 Электронная микроскопия
2.5.18 Выявление генов кодирующих 168 рибосомальную
РНК в межклеточном матриксе
2.5.19 Изучение липидного состава бактериальных сообществ
2.5.20 Статистические методы
Глава 3 Результаты собственных исследований
3.1 Свойства использованных штаммов и характеристика биопленок
3.2 Определение липидного состава матрикса микробных сообществ

Препараты ДНК в количестве 1 мкг/мл наносили в растворе 10 шМ MgCl2 20 mM NI-14-ацетат на поверхность свежесколотой слюды, адсорбировали 10 минут, смывали бидистиллированной водой и высушивали. Препарат изучали на микроскопе Nanoscope 2 (Digital Instr. США) с использованием нитрид кремниевого зонда, при скорости сканирования 7 герц. Электронная микроскопия выполнена в лаборатории “Структура и функции генов человека” Института биоорганической химии им. М.И. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, за что автор выражает глубокую признательность руководителю лаборатории академику РАН Е.Д. Свердлову и Клинову Д.В.
2.5.18 Выявление генов кодирующих 16S рибосо-мальную РНК, в межклеточном матриксе
Внеклеточную ДНК из матрикса биопленок выделяли при помощи фенол-хлороформного метода экстракции нуклеиновых кислот. Для поиска 16S рибосомальной ДНК нами была выбрана следующая пара оли-гонуклеотидных праймеров: 5’-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3' и 5’-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3' с длиной ампликона равной 466 нуклеотидов (Бласт). Синтез праймеров был осуществлен в ООО “Синтол”. ПЦР проводили в присутствии 0,2% шМ каждого из дезокси-нуклеотидтрифосфатов 2,5 шМ MgCI2, 30 шМ Трис-НС1 (pH 8,5 при +25°С), 16 шМ (NH4)2S04, 0,1% Nonidet Р40 (“Sigma”), по 0,5 мкл оли-гонуклеотидных праймеров и 2,5 Ед Dia Taq ДНК полимеразы (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребсоюза, Росси) на амплификаторе “Teche” (Англия). Условия проведения ПЦР: 95°С 3 мин 30 сек; затем 94°С 15 сек, 58°С 30 сек; 72°С 45 сек - 37 циклов; затем 72°С 7 минут 35 секунд. ПЦР фрагменты анализировали электрофорезом в 2% агарозном геле окрашиванием бромистым этидием. С помощью маркера молекулярной массы (100 bp DNA Ladder BioLabs 500 мкг/мл) подтверждали соответст-