Филогенетическая гетерогенность серных спирилл и физиология микроаэрофильных представителей

• Автор: Подкопаева, Дарья Александровна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 170 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ:
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Краткая историческая справка таксономического и фенотипического исследования серных спирилл рода Thiospira
1.2. Окислительный стресс и системы защиты микроорганизмов от токсичных форм кислорода
1.2.1. Окислительный стресс и пути образования активных форм кислорода
1.2.2. Влияние АФК на клеточные компоненты микроорганизмов и чувствительность бактерий к продуктам неполного восстановления кислорода
1.2.3. Ферментативные способы защиты бактерий от АФК
1.2.4. Неферментативные способы защиты от АФК
1.3. Роль серных соединений в метаболизме гетеротрофных бактерий
1.3.1. Использование соединений серы в детоксикации АФК у
гетеротрофных сероокисляющих бактерий
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объекты исследования
2.2. Материал для выделения
2.3. Состав питательных сред
2.4. Методы изучения морфологии, ультроструктуры и внутриклеточных включений у гетеротрофных спирилл
2.5. Физиолого-биохимические исследования
2.6. Техника микроаэробного культивирования
2.7.Молекулярно-генетические методы анализа
2.7.1. Генотипические свойства
2.7.2. ПЦР гена 16SpPHK
2.7.3. Определение нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК и филогенетический анализ
2.8. Получение клеточной суспензии и ферментных препаратов
2.9. Методы определения активности ферментов
2.9.1. Определение активности ферментов, участвующих в удалении токсичных форм кислорода
2.9.2. Определение активности ферментов, приводящих к синтезу ФЕП и углеводов
2.9.3. Определение активности ферментов ЦТК и глиоксилатного

цикла
2.9.4. Определение активности ферментов, поставляющих субстраты для синтеза аминокислот
2.9.5. Определение активности ферментов, участвующих в
превращениях восстановленных соединений серы
2.10. Физико-химические методы анализа
2.10.1 Определение белка
2.10.2. Методы определения концентрации кислорода
2.10.3. Радиоуглеродный метод определения интенсивности декарбоксилирования органических кислот
2.10.4. Анализ неорганических соединений серы
2.10.5. Определение ацетата
2.10.6. Определение общего содержания углеводов
2.10.7. Определение Н202
2.10.8. Определение концентрации АТФ в клетках бактерий
2.10.9. Определение убихинонов
2.10.10. Методика идентификации микроорганизмов по составу
клеточных жирных кислот
2.10.11. Определение метаболитной антиокислительной активности
2.10.12. Статистическая обработка экспериментальных данных
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Выделение и характеристика новых микроаэрофильных серных спирилл
3.1.1. Условия выделения. Морфология и ультроструктура спирилл
3.1.2. Фенотипические свойства микроаэрофильных гетеротрофных серных спирилл
3.1.2.1. Культуральные и физиолого-биохимические свойства
3.1.2.2. Влияние кислорода на накопление клеточной биомассы спирилл
3.1.3. Молекулярно-генетические исследования микроаэрофильных серных спирилл
3.1.3.1. Филогенетический анализ новых штаммов
3.1.3.2. Генотипические исследования
3.2. Пересмотр таксономического положения представителей рода Aquaspirillum
3.2.1. Филогенетический анализ
3.2.2. Генотипические исследования
3.2.3. Хемотаксономические исследования
3.2.4. Сравнительный анализ физиолого-биохимических свойств аэробных спирилл
3.3. Влияние кислорода на ростовые процессы и накопление

клеточной биомассы у микроаэрофильных серных спирилл
3.4. Окислительный стресс и системы антиоксидантной защиты у бесцветных серобактерий
3.4.1. Влияние кислородного режима культивирования на скорость образования Н2О2 в клетках микроаэрофильных серных спирилл б1. vinogradskii
3.4.2. Ферментативные системы защиты от токсичных форм кислорода
3.5. Влияние кислородного режима культивирования на биосинтетические процессы у 5. vinogradskii
3.6. Функциональная роль серных соединений в энергетическом и конструктивном метаболизме микроаэрофильных серных спирилл
3.6.1. Влияние концентрации кислорода и восстановленных серных соединений на ростовые процессы
3.6.2. Механизм окисления восстановленных серных соединений
3.6.3. Образование АТФ в клеточной
суспензии
3.6.4. Активность ферментов серного
метаболизма
3.6.5. Влияние тиосульфата на конструктивный метаболизм б. vinogradskii
3.7. Функциональная роль тиосульфата в антиоксидантной защите
клеток у гетеротрофных сероокисляющих бактерий
ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Нуклеотидную последовательность полученного фрагмента определяли с использованием набора ферментов CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing kit (Beckman Coulter, США) на автоматическом ДНК секвенаторе «CEQ2000 XL» (Beckman Coulter, США) в соответствии с предлагаемым фирмой протоколом. Первичный анализ сходства полученных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК проводили с помощью программы BLAST. Нуклеотидную последовательность гена 16S рРНК изучаемого организма или группы организмов выравнивали с соответствующими последовательностями ближайших видов с помощью программы CLUSTAL X (Tompson et al., 1997). Эволюционное расстояние, выраженное как число замен на 100 нуклеотидов, рассчитывали согласно (Jukes, Cantor, 1969). Построение филогенетического древа производили с помощью пакета программ TREECON (Van de Peer, De Wächter, 1994) с использованием метода neighbor-joining (NEIGHBOR) (Saitou, Nei, 1987). Статистическая достоверность ветвления оценивалась с помощью "bootstrap-анализа" 1000 альтернативных деревьев, используя соответствующую функцию программы TREECON.
2.8. Получение клеточной суспензии и ферментных препаратов
Суспензию клеток получали путем центрифугирования культуры микроорганизмов при 5000 g, 4°С, в течение 30 минут. Клетки отмывали 0,1 моль/л трис-НС1-буфером (pH 7,5) и осаждали при тех же режимах центрифугирования в течение 20 минут.
Клеточные экстракты (гомогенат) получали в результате разрушения бактериальных клеток с помощью ультразвукового дезинтегратора УЗДН -2Т при мощности 500 Вт и частоте 22 кГц в течение 2 минут на ледяной бане. Супернатант (цитоплазматическую фракцию) получали после центрифугирования гомогената при 9000 g и 4° С в течение 30 минут.