Катаболизм нитрильных соединений у Rhodococcus rhodochrous : Генетический контроль, механизмы регуляции и промышленное использование

• Автор: Яненко, Александр Степанович
• Шифр специальности: 03.00.15, 03.00.07
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 115 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
МАТЕРИАЛЫ И ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1.ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ И ТАКСОНОМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ СКРИНИНГА
БАКТЕРИЙ, СПОСОБНЫХ УТИЛИЗИРОВАТЬ НИТРИЛЫ
1.1. Таксономическое разнообразие изолятов
1.2. Анализ путей утилизации нитрилов у отобранных изолятов
2. БАКТЕРИАЛЬНЫЙ ШТАММ RHODOCOCCUS RHODOCHR О US М8: ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ОСОБЕННОСТИ КАТАБОЛИЗМА НИТРИЛОВ
2.1. Общее описание штамма
2.2. Свойства нитрилгидратазной активности штамма R. rhodochrous М
2.3. Физико-химические и каталитические свойства амидазы из R. rhodochrous М8.
3.ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ КАТАБОЛИЗМА НИТРИЛОВ У
R. RHODOCHROUS М
3.1. Разработка систем клонирования и переноса генов для Rhodococcus spp
3.2. Исследование локуса хромосомы R.rhodochrous М8, контролирующего утилизацию нитрилов
3.3. Экспрессия клонированного гена НГ
3.4. Выделение и свойства мутантов с измененной способностью
утилизировать нитрилы
4. МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ КАТАБОЛИЗМА НИТРИЛОВ У R.rhodochrous М
4.1. Амид-зависимая индукция синтеза НГ и AM
4.2. Кобальт-зависимая регуляция НГ активности в R.rhodochrous М
4.3. Углеродная катаболитная репрессия метаболизма нитрилов у R.rhodochrous М
4.4. Роль ионов аммония в регуляции метаболизма нитрилов у R.rhodochrous М8
5. ПРОМЫШЛЕННОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НИТРИЛУТИЛИЗИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ.
5.1. Создание биокатализаторов на основе штамма R.rhodochrous М
5.2. Получение акриламида с помощью биокатализа
5.3. Баокаталитический метод получения никотинамида
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы
В основе современных методов получения разнообразных синтетических соединений лежат каталитические процессы, которые, как правило, проводят при высоких температурах и давлении в присутствии сложных гетерогенных катализаторов. Использование в качестве катализаторов клеток микроорганизмов или их ферментов позволяет осуществить такие процессы при мягких условиях (низкие температуры, нейтральная водная среда) с высокой селективностью и специфичностью. В отличие от традиционных катализаторов, биокатализаторы способны также осуществлять стереоселективные и регеоселективные реакции. Таким образом, биокаталитические процессы формируют новый облик химии, основанной на энергосберегающих, безотходных и экологически безопасных технологиях. Однако, в современной химической индустрии использование биокатализа все еще ограничено. Во многих случаях биокаталитические процессы неспособны конкурировать с традиционными технологиями по уровню себестоимости продукта. Большой прогресс в области изучения структуры и функций ферментов, массовое секвенирование геномов бактерий, успехи метаболической инженерии, исследование микробного биоразнообразия, развитие новых методов направленной эволюции позволяют надеятся, что биотехнологии все шире будут внедрятся в химическую промышленность, способствуя становлению новой отрасли-«зеленой химии».
Идеи о возможности использования в качестве биокатализаторов ферментов (нитрилгидратаз и нитрилаз), участвующих в метаболизме нитрилов, были высказаны уже в первых работах, посвященных изучению нитрилутилизирующих бактерий (в начале 70 годов). Первой реализовала эту идею компания Нитто (Япония), создав производство акриламида, основанное на биокатализе. В качестве биокатализаторов были использованы бактериальные штаммы -Corynebacterium (Rhodococcus) sp. N-774 и Pseudomonas chlororaphis В-23, обладающие нитрилгидратазной активностью (Watanabe et al.,1987; Asano et al.,1982). Несмотря на значительные преимущества биокаталитического метода по сравнению с традиционными химическими технологиями, используемые биокатализаторы, обладали рядом недостатков: их активность ингибировалась
акриламидом и, как следствие этого, с их помощью удавалось получать в промышленных условиях растворы, содержащие не более 27% акриламида. Для получения товарной формы (40-50% растворы) требовалась стадия концентрирования. Кроме того,

биокатализаторы обладали достаточно высокой активностью амидазы, функционирование которой приводило к накоплению акриловой кислоты, что ухудшало качество получаемого акриламида.
Для совершенствования параметров биотехнологического процесса требовалось создание биокатализаторов нового поколения, лишенных указанных недостатков. Мы полагали, что эта задача может быть решена с помощью широкого поиска новых нитрилгидратаз с уникальными свойствами и изучения механизмов, контролирующих синтез нитрилгидратаз в клетках бактерий.
Настоящая работа обобщает результаты изучения бактерий, обладающих нитрилгидратазной активностью и является первым примером комплексного исследования метаболизма нитрильных соединений у родококков на генном и клеточном уровне.
Цель и задачи исследования
Основной целью настоящей работы было изучение механизмов регуляции метаболизма нитрилов у Ююйососсия г/гос^оскгош и на этой основе развитие новых биокаталитических процессов с использованием ферментов, участвующих в утилизации нитрильных соединений.
В соответствии с этим в работе решались следующие задачи:
1. Создание представительной коллекции нитрилутилизирутощих бактерий. Выбор штамма с нитрилгидратазной активностью, обладающего потенциалом для промышленного использования.
2. Изучение ключевых ферментов метаболизма нитрилов - нитрилгидратазы (НГ) и амидазы (АМ) у штамма КтНойоскгож М8, обладающего высоким потенциалом для промышленного использования. Идентификация и характеристика основных механизмов регуляции синтеза НГ и АМ.
3. Разработка системы генетического анализа для родококков.
4. Изучение генетического контроля утилизации нитрилов у Кг}юс1ос}1гош М8.
5. Разработка стратегии повышения НГ активности и создание промышленных биокатализаторов для получения акриламида на основе штамма К.гко(1осЬгот М8.
6. Разработка биокаталитических процессов получения амидов, прежде всего, акриламида и никотинамида.

сопровождается накоплением в КЖ трех метаболититов - ацетамида, уксусной кислоты и аммония, причем появление ацетамида предшествует появлению уксусной кислоты.

! 5 о
I =Г °

10 20
Время, час

-АсЫ -АсА -Ас -НГ -ОП
Рис. 11. Рост штамма М8 на ацетонитриле.
Штамм М8 растили на среде МС с ацетонитрилом (60 мМ) в течении
час. Содержание субстрата-ацетонитрила (АсИ) и метаболитов-ацетамида (АсА) и
уксусной кислоты (Ас) определяли с помощью ГХ.
Образование амида в качестве промежуточного продукта метаболизма нитрилов однозначно указывало на двухстадийный путь утилизации нитрилов с участием ферментов - нитрилгидратазы (НГ) и амидазы (АМ) согласно уравнению (1):
НГ АМ
► Я-СОЫН2 ► Амид Я-СООН + >Щз(1) кислота
я-си
нитрил нитрилаза
► Я-СООН + Ш3 (2)
Активности НГ и АМ возрастали по мере роста культуры М8 и достигали максимальных значений к моменту полной утилизации амида (Рис. 11). После чего активность обоих ферментов быстро снижалась.