Изучение свойств штаммов Escherichia coli M-17 и bacillus subtilis 1719 на модели экспериментального дисбиоза

• Автор: Гайдеров, Андрей Александрович
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 91 с. : 5 ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВА - высокоадгезивный микроорганизм ЖКТ - желудочно-кишечный тракт
ЗФР - забуференный фосфатами физиологический раствор ИАМ - индекс адгезивности микроорганизма КР - колонизационная резистентность КОЕ - колониеобразующая единица
К - коэффициент, процент эритроцитов, имеющих на своей поверхности прилипшие микробы
КРС - сыворотка крупного рогатого скота
ЛПС -липополисахарид
МПА - мясопептонный агар
МПБ - мясопептонный бульон
НД - нормативная документация
ОЕ - оптические единицы
ОКИ - острые кишечные инфекции
ПБ - пробиотики
СПА - средний показатель адгезии ТМВ - тетраметилбензидин
УПМ/УПБ - условно-патогенные микроорганизмы/бактерии
ФС - фармакопейная статья
ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка
ЭД - экспериментальный дисбиоз

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА 1. НОРМАЛЬНАЯ МИКРОФЛОРА
1Л. Микрофлора кишечника и ее роль в обеспечении состояния
здоровья организма хозяина
1.2. Нарушения колонизационной резистентности - дисбиозы и их 12 классификация
ГЛАВА 2. ПРИМЕНЕНИЕ ПРОБИОТИКОВ В ПРАКТИКЕ ЗДРАВО
ОХРАНЕНИЯ
2 Л. Пробиотики на основе Escherichia coli
2.2. Пробиотики на основе бактерий рода Bacillus
ЧАСТЬ II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1.1. Материалы
1.2. Методы
1.2.1. Исследование культурально-биохимических свойств бакте- 25 рий рода Bacillus
1.2.2. Исследование культурально-биохимических свойств мик- 25 роорганизмов
1.2.3. Определение адгезивной активности
1.2.3.1. Метод определения адгезии микробов к эритроцитам
1.2.3.2. Метод определения адгезии микробов к эпителиальным 27 клеткам кишечника лабораторных животных
1.2.4. Определение антагонистической активности
1.2.5. Оценка количественного и качественного состава микро- 29 флоры
1.2.6. Моделирование экспериментального дисбиоза
1.2.7. Изучение органно-тканевой транслокации
1.2.8. Определение функциональной активности альвеолярных 30 макрофагов
1.2.9. Определение фагоцитарной активности нейтрофилов
1.2.10. Определение уровня цитокинов
1.2.11. Методы изучения безопасности
1.2.11.1. Изучение острой и хронической токсичности
1.2.11.2. Изучение безвредности

1.2.11.3. Изучение вирулентности
1.2.11.4. Изучение токсичности
1.2.11.5. Изучение токсигенности
1.2.12. Методы статистической обработки результатов исследований
ГЛАВА 2. ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ И
БЕЗОПАСНОСТИ ПРОБИОТИЧЕСКИХ КУЛЬТУР IN VITRO И IN
VIVO
2.1 Изучение культуральных, биохимических и морфологических 39 свойств
2.2 Изучение безопасности штаммов
2.3 Изучение антагонистических свойств
2.4. Выбор оптимальной композиции штаммов
ГЛАВА 3. МОДЕЛИРОВАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ДИСБИО
ЗА И ЕГО КОРРЕКЦИЯ ПРОБИОТИЧЕСКИМИ ШТАММАМИ, А ТАКЖЕ ИХ КОМПОЗИЦИЕЙ
3.1. Моделирование дисбактериоза на мышах и его коррекция
3.2 Изучение адгезии микроорганизмов в условиях эксперимен- 52 тального дисбиоза
3.3 Изучение бактериальной транслокации в условиях экспери- 59 ментального дисбиоза
3.4. Изучение факторов неспецифического иммунитета на модели 61 экспериментального дисбиоза
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

тест-системы производства «Bio-Source», Бельгия; для ФНО-а использовали коммерческий набор ОртЕ1А™ ELISA Kit, USA.
Приготовление образцов плазмы крови.
Животное умерщвляли декапитированием. Собранная кровь отстаивалась в течение нескольких часов при t=4 °С. Сыворотку центрифугировали (1,0x103 об/мин, 20 мин), после чего надосадочную жидкость переносили в эппендорфы. Измерение ФНО проводили непосредственно в свежеприготовленной плазме крови или допускали однократное замораживание образцов (для предупреждения бактериального роста).
Питотоксический тест для определения концентрации ФНО - а.
Тест на цитотоксичность проводили индивидуально для каждой мыши в условиях двух независимых экспериментов (п=6); для каждого образца было использовано 9 повторов измерения. Клетки L929 культивировали в плоскодонных 96-луночных планшетах по 2x104 клеток на лунку в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки ЭТС, 1% L- глютамина, 100 мкг/мл стрептомицина при 37 °С в 5% С02 в течение 24 ч. На следующие сутки к образованному монослою клеток L929 добавляли 1 мкг/мл актиномицина D (Sigma, USA), чтобы остановить рост клеток-мишеней, и дополняли лунки приготовленными образцами (плазма крови) по 100 мкл на лунку. К контрольным лункам помимо актиномицина D добавляли среду RPMI-1640 с 10% ЭТС. Заполненный планшет инкубировали в течение 24 ч при 37 °С и 5% С02. После окончания инкубации супернатант удаляли, а монослой клеток 1-2 раза промывали физиологическим раствором. Выживаемость клеток определяли окрашиванием при добавлении 100 мкл 0,05% раствора Crystal Violet (Sigma, USA) в 2% этаноле в течение 7 мин. После тщательного полоскания планшета под струей дистиллированной воды в каждую лунку добавляли по 100 мкл 1 % до-децилсульфата натрия для растворения кристаллов красителя в выживших клетках L929. Оптическую плотность измеряли при 546 нм на спектрофотометре для планшетов (Titertek Multiscan МСС/340, Flow Laboratories, Finland). Индекс цитотоксичности (ИЦ) клеток рассчитывали по формуле: