Действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на перевиваемые культуры клеток

• Автор: Каменек, Дмитрий Валерьевич
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 130 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. BACILLUS THURING1ENS1S КАК ОБЪЕКТ БИОТЕХНОЛОГИИ
1.2. СИСТЕМАТИКА И ЭКОЛОГИЯ В. THURING1ENSIS
1.3. ФАКТОРЫ ПАТОГЕННОСТИ BACILLUS THURING1ENS1S
1.4. КРИСТАЛЛИЧЕСКИЕ ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИНЫ
1.5. ДЕЙСТВИЕ ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИНОВ НА ЦЕЛЕВЫЕ ОБЪЕКТЫ
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМА
2.2. КЛЕТОЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ
2.3. ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИНА
2.4. СПЕКТРАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИНА
2.5. МЕТОДЫ СВЕТОВОЙ МИКРОСКОПИИ
2.6. БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. ЦИТОПАТИЧЕСКДЯ АКТИВНОСТЬ ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИНА BACILLUS
THURING1ENS1S
3.2. МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИНА НА КЛЕТОЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ ТКАНЕЙ
3.3. ДЕЙСТВИЕ ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИНА НА СОДЕРЖАНИЕ ИОНОВ В КЛЕТКАХ ПЕРЕВИВАЕМЫХ ЛИНИЙ
3.4. ДЕЙСТВИЕ ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИНА НА ДЫХАТЕЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ И СИНТЕЗ АТФ В КЛЕТКА
3.5. ВЛИЯНИЕ ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИНА НА ПРОЦЕСС ГЛИКОЛИЗА
3.6. ПОДТВЕРЖДЕНИЕ РАЗОБЩАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИНА BACILLUS THUR1NGIENSIS МЕТОДАМИ ИК- И ЯМР-СПЕКТРОСКОПИИ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы: Bacillus thuringiensis является широко
распространенной в природе кристаллофорной спорообразующей бактерией. Известны ее энтомопатогенные свойства и промышленные препараты на основе бактерии являются наиболее важными средствами биологического контроля численности насекомых во многих странах.
Известно, что основным действующим началом В. thuringiensis, ответственным за комплекс патологических проявлений в организме чувствительного насекомого, является дельта - эндотоксин, продуцируемый ею. Показана также антимикробная активность дельта-эндотоксинов
В. thuringiensis для различных бактерий и микроскопических грибов (Юдина и Бурцева, 1997; Климентова, 2001; Тюльпинева, 2003; Каменек и соавт., 2005). Отмечали кроме того селективное ингибирующее действие белков кристаллов subsp. thuringiensis на развитие опухолевых клеток млекопитающих, в том числе человека (Prasad & Shethna, 1976; Ito et al., 2004). Эндотоксины предпочтительно убивали раковые клетки НеР, не оказывая влияния на развитие нормальных клеток. Все это дает основание предположить, что В. thuringiensis и её кристаллический дельта-эндотоксин являются важным универсальным высокоизбирательным природным регулятором численности самых различных организмов.
Создание и применение средств на основе дельта-эндотоксина позволило бы не только обеспечить максимальную эффективность и экологическую безвредность мероприятий по защите растений от вредных насекомых и фитопатогенных микроорганизмов, но и, возможно, решить целый ряд медицинских и ветеринарных проблем. Прежде всего, разработать препаративные формы, обладающие антимикробной и противораковой активностью и не токсичные для нормальных клеток. Их разработке должны предшествовать исследования, выполненные на культурах клеток.
В мировой литературе накоплен обширный материал, описывающий строение, состав, физико-химические свойства кристаллов. Установлено, что

дельта-эндотоксины способны связываться с чувствительными рецепторами на цитоплазматических мембранах клеток кишечного эпителия, а затем проникать в них, формируя каналы-поры (Hodgman & Ellar, 1990; Smith & Ellar, 1994). Изучены особенности механизма действия на насекомых, включая клеточные культуры. Отмечается нарушение транспорта ионов, активирование АТРаз, снижение синтеза АТФ на фоне усиления потребления кислорода, разобщение процессов окислительного фосфорилирования и дыхания (Heimpel, 1977; Faust, 1984; Aronson et al., 1986; Gill et al., 1992; Himeno et al., 1985; Каменек, 1998). Проведены также исследования влияния на млекопитающих кристаллов белкового дельта-эндотоксина, которые подтвердили, что эти белки и продукты их расщепления не токсичны и не аллергенны для теплокровных организмов (Киль и Надыкта, 2002). Вышесказанное позволило определить цель и задачи исследования.
Цель настоящего исследования - охарактеризовать по морфологическим и биохимическим параметрам этапы действия дельтаэндотоксина Bacillus thuringiensis subsp. sotto и выявить особенности механизма его действия на клетки перевиваемых линий НеЬа, В16 и L1210.
Основные задачи исследования:
1. Выявить общее цитопатическое действие дельта-эндотоксина и охарактеризовать силу его эффекта по отношению к клеткам перевиваемых линий НеЬа, В16 и L1210.
2. Определить влияние дельта-эндотоксина на ионный гомеостаз клеточных линий, установив факт нарушения транспорта основных неорганических ионов (К+, Na+, Са2+ и Mg2) вследствие изменения активности основного ионного транспортера - К+, Na - АТФазы.
3. Установить возможность действия дельта-эндотоксина как агента, разобщающего дыхание и фосфорилирование в клетках перевиваемых культур.

эндотоксины могут реагировать с несколькими лигандами на поверхности клеточных мембран (Van Rie et al., 1990 b).
Протеолитическая активация дельта-эндотоксинов способствует усилению их сродства к мембранным рецепторам, величина которого для токсина subsp. berliner достигает 25 раз (Hofmann et al., 1988).
В настоящее время активно изучается природа чувствительных рецепторов и механизм их взаимодействия с дельта-эндотоксинами. Установлено, что рецепторами клеток-мишеней, с которыми связывается дельта-эндотоксин, являются мембранные гликопротеиды с концевыми N-ацетил-О-галактозаминовыми участками в качестве непосредственного акцептора (Hofmann et al., 1985). Для одного из активных для чешуекрылых эндотоксинов - Cry 1 Ас - были определены как мембранный рецептор, так и локализованный в нём специфический лиганд. Показано, что рецептором является аминопептидаза- N , а непоредственно связывающим токсин фрагментом аминопептидаза- N - молекула N-ацетилгалактозамина (Masson et al., 1995).
Было показано, что N-ацетилгалактозамин-чувствительной является только начальная фаза связывания рецептора. Более поздние стадии процесса не были восприимчивы ни к этому аминосахариду, ни к агентам, нарушающим белок-белковые взаимодействия (Li et al., 2001), что становится понятным в свете представлений о формировании токсином пор в мембране клетки.
Полагают, что дельта-эндотоксины семейства Cyt реагируют не со специфическими рецепторами, а с ненасыщенными фосфолипидами (Thomas& Ellar, 1983; Haider& Ellar, 1989: Knowles& Ellar, 1987). Тот факт, что мембраны двукрылых характеризуются высоким содержанием ненасыщенных фосфолипидов, может являться причиной преимущественной активности Cyt-белков против данной группы насекомых (Ravoahangimalala, Charles, 1995).
Внедрение в мембрану. В ходе взаимодействия с рецепторами дельтаэндотоксины подвергаются конформационным изменениям, обеспечивающим преобразование растворенного токсина в структуру, способную встроиться в