Исследование оксидаз caa3- и cbb3-типа у бактерий рода Bacillus

• Автор: Попова, Ирина Вячеславовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 131 с. : ил.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА 1. АЛКАЛОФИЛЬНЫЕ ВИДЫ BACILLUS
1. Таксономия рода Bacillus
2. Актуальные проблемы классификации рот Bacillus
3. Идентификация штамма Bacillus sp. FTU
4. Промышленное значение Bacillus spp
ГЛАВА II. ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ АЛКАЛОФИЛОВ
1. Мембранные липиды
2. Компоненты дыхательной цепи
2.1. Цитохром с
2.2. Сукцинат-хинон оксидоредукгаза
2.3. Небелковые компоненты
ГЛАВА III. ГЕМ-СОДЕРЖАЩИЕ ТЕРМИНАЛЬНЫЕ ОКСИДАЗЫ
1. Оксидаза сааз-типа
2. Цитохром-с-оксидаза сЬЬз-т&па
3. Другие цитохром-е-оксидазы
ГЛАВА IV. ГИПОТЕЗА ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ АЛКАЛОФИЛОВ
1. Высокий трансмембранный потенциал ( АТ1) и его локализация
2. Низкий внутриклеточный pH и pH вблизи наружной
поверхности мембраны
ГЛАВА V. ГЕНОМИКА

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 1. Культивирование бактерий
1. Хранение культуры бактерий Bacillus pseudoflrmus FTU
2. Культивирование Bacillus pseudofirmus FTU в жидкой
питательной среде в небольших объемах
3. Культивирование Bacillus halodurans 2513
Глава II. Препаративные методы.
1. Подготовка клеточной суспензии к экспериментам
2. Выделение мембранных частиц Bacillus pseudofirmus FTU
3. Выделение и очистка герминальных оксидаз сааз - и
сЬЬз-тшюъ Bacillus pseudofirmus FTU
4. Приготовление протеолипосом
5. Выделение ДНК из бактерий
Глава III. Аналитические методы.
1. Измерение концентрации белка
2. Измерение дыхательной активности
3. Спектральный анализ гемсодержащих препаратов
суббакгериальных мембранных частиц Bacillus pseudofirmus FTU
4. Изучение ионтранспортных свойств оксидаз Bacillus pseudofirmus FTU
на целых клетках методом малых добавок кислорода
5. Измерение мембранного потенциала
5.1. Измерение мембранного потенциала с использованием
сафранина
5.2. Измерение мембранного потенциала с использованием ТФФ+
6. Электрофорез в денатурирующих условиях
7. Электрофорез в неденатурирующих условиях
8. Окрашивание гелей на белок
9. Окрашивание гелей на гем
10. Окрашивание гелей на оксидазную активность
11. Определение содержания ДНК в материале
12. Горизонтальный электрофорез ДНК в 1% агарозном геле
13. Амплификация фрагментов бактериальной ДНК
14. Выделение амплифицированных фрагментов ДНК
15. Определение нуклеотидной последовательности в амплифицированных фрагментах ДНК
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ РЕАКТИВОВ
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 1. Встраивание оксидазы сааз-типа в липосомы
ГЛАВА II. Изучение влияния жирных кислот на энергосопрягающую
систему бактерий Bacillus pseudofirmus FTU
ГЛАВА III. Обнаружение и идентификация оперона оксидазы
сйбз-типа у бактерий рода Bacillus
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
5.2. Измерение мембранного потенциала с использованием ТФФ+.
Измерение мембранного потенциала с использованием тетрафенилфосфония (ТФФ+) проводили с помощью ТФФ+-селективного электрода (Hockings P.D., Rogers P.J., 1996) в термостатированной ячейке при 25°С с интенсивной аэрацией при постоянном перемешивании. Электрод калибровали добавками ТФФ+; конечная концентрация ТФФ+ составляла 4 мкМ. Расчет ДЧР проводили по модифицированному уравнению Нернста:
A'P=2.3RT/F lgк (10ЛЕ/59 -1) К
6. Электрофорез в денатурирующих условиях,
Электрофорез в ПААГ проводили по методу Леммли (Laemmli, 1970) при комнатной температуре в пластинах толщиной 1мм при силе тока 40 мА на одну пластину в присутствии 3,5 мМ ДСН (соотношение по массе метиленбисакриламид/акриламид - 1:36). Образцы перед нанесением инкубировали в буфере, содержавшем 60 мМ трис, 3,5 мМ ДСН, 10% (масс/об) сахарозы, 5% (об/об) ß-меркаптоэтанола, в течение 5 минут на кипящей водяной бане. Гели фиксировали в смеси изопропанол / этанол / ледяная уксусная кислота / вода (1:5:5:1) и окрашивали на белок или тем.
7. Электрофорез в неденатурирующих условиях.
Электрофорез в неденатурирующих условиях проводили согласно методу, описанному Дэвисом (Davis, 1964), с небольшими модификациями: к
полиакриламидному гелю добавляли 0,3% детергента Тритон Х