Изучение белков предстательной железы человека при раке и доброкачественной гиперплазии с помощью постгеномных технологий

• Автор: ЕРЕМИНА, ЛИДИЯ СЕРГЕЕВНА
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 123 с. : 25 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. Изучение молекулярных нарушений в тканях предстательной железы человека при опухолевой трансформации (обзор литературы)
1.1 Общие характеристики злокачественных опухолей предстательной железы и
основные тенденции в их биохимических исследованиях
1,2. Протеомные исследования тканей и клеток предстательной железы человека в норме и при опухолевой трансформации
1.2.1. Возникновение системного анализа белков как продуктов генной экпрес-сии. Исследования белков предстательной железы человека в догеномный период
(до 1989 г.)
1.2.2. Исследования белков предстательной железы человека в геномный период (1989 - 2001 гг.)
1.2.3. Исследования белков предстательной железы человека в постгеномную
эру (с 2001 г.)
1.3. Молекулярно-генетические исследования предстательной железы человека
при опухолевой трансформации
1.4. Поиски молекулярных маркеров рака предстательной железы с использованием постгеномных технологий
1.5. Исследования полиморфизма некоторых актин-связывающих белков при раке предстательной железы человека
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1. Реактивы и биологические материалы
2.1.1. Реактивы
2.1.2. Биологические материалы
2.2. Подготовка образцов для проведения электрофоретических исследований
2.3. Фракционирование белков одномерным электрофорезом по Лэммли
2.4. Фракционирование белков двумерным электрофорезом
2.4.1. Изоэлектрофокусирование и неравновесное фокусирование в полиакриламидном геле в градиенте pH, сформированном амфолинами
2.4.2. Изоэлектрофокусирование в иммобилиновом градиенте pH
2.4.3. БОБ-электрофорез в пластинах полиакриламидного геля
2.5. Детекция белков на гелевых пластинах. Дениситометрия одномерных и двумерных электрофореграмм. Компьютерный анализ результатов. Хранение гелевых пластин
2.6. Иммуноблоттинг

2.7. Масс-спектрометрическая идентификация белков
2.8. Определение концентрации белков
2.9. Методы получения препаратов ДНК и формирования ДНК-коллекций
2.10. Метод дискриминации аллелей с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для исследования однонуклеотидных полиморфизмов

2.11. Статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3. Полученные результаты и их обсуждение
3.1. Исследование белкового состава тканей предстательной железы человека с помощью протеомных технологий
3.1.1. Формирование обобщенной двумерной карты белков простаты
3.1.2. Масс-спектрометрическая идентификация белков предстательной железы на двумерной карте. Различия белковых паттернов образцов с раком и доброкачественной гиперплазией
3.2. Изучение изменчивости белков в тканях предстательной железы человека
3.2.1. Изоформы актин-связывающих белков в тканях предстательной железы
3.2.2. Полиморфизм ПСА в тканях предстательной железы
3.2.3. Полиморфизм енолазы 1 в тканях предстательной железы
3.2.4. Уточнение «конфликтных» определений аминокислотных последовательностей идентифицированных белков предстательной железы
3.2.5. Пилотное исследование однонуклеотидных полиморфизмов в некоторых генах, экспрессирующихся в тканях предстательной железы
3.3. Изучение специфичности и возможностей клинического использования потенциальных белковых маркеров рака предстательной железы человека
3.4. Формирование макетной версии компьютерной базы данных о «мажорных» белках предстательной железы человека
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ
БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АА акриламид
а.о. аминокислотные остатки в белках
АСБ актин-связывающие белки
АТФ аденозинтрифосфат
ДГПЖ доброкачественная гиперплазия предстательной железы
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
(к)Да (кило)дальтон
МБА метиленбисакриламид
Мм молекулярная масса
(м)РНК (матричная) рибонуклеиновая кислота
ПААГ полиакриламидный гель
ПЖ(Ч) предстательная железа (человека)
ПСА просгатспецифический антиген
ПЦР, PCR полимеразная цепная реакция
РПЖ рак предстательной железы
ТЕМЕД ГЧГМ'-тетраметилэтилендиамин
2D-DIGE двумерный дифференциальный электрофорез в геле
2D(-PAG)E двумерный электрофорез (в полиакриамидном геле)
ESI электроспрейная ионизация
ICAT метод изотопно меченных аффинных мишеней
IEF изоэлектрофокусирование
IEF-PAGE электрофорез в градиенте pH, созданном амфолитами
Ig иммуноглобулин
IPG-PAGE электрофорез в иммобилизованном градиенте pH
MALDI(-TOF) опосредованная матрицей (времяпролетная) лазерная десорб-
ция/ионизация MS масс-спектрометрия
MS/MS тандемная масс-спектрометрия
Mud-LC многомерная жидкостная хроматография
NCBI национальный центр биотехнологической информации в США
(National Centre for Biotechnology Information)
NEPHGE неравновесный электрофорез в градиенте pH
OMIM компьютерная база данных о менделирующих признаках чело-
века (Online Mendelian Inheritance in Man), входящая в банк данных NCBI pi изоэлектрическая точка
PBS Na-фосфатный буфер

раке молочной железы и раке легкого [Брызгунова О.Е. и др. 2007]. Анализ сайтов метилирования/деметилирования ДНК в опухолевых клетках проводят с помощью количественной ПЦР, специфичной к метилированию.
Результаты молекулярно-генетических исследований свидетельствуют об определенной стадийности генетических изменений при РПЖ: на поздних стадиях прогрессии наблюдаются изменения генов, которые не обнаруживаются на ранних этапах развития опухоли. Так, делеции бц (ген ICF2R) и 8р (ген NKX3-1) появляются на ранних стадиях РПЖ, в то время как делеции 10q (ген PTEN), 13q (ген RB1), 17р (ген ТР53) и амплификации - в ходе прогрессии, главным образом в метастатических и гормоннезависимых опухолях. Для метастатического и гормонрезистентного РПЖ характерны соматические мутации в гене AR [Elo J.P. et al. 1995; Taplin М.Е. et al. 2003].
Для изучения молекулярных изменений при РПЖ часто используется анализ уровня транскриптов мРНК [Luo J. et al. 2002] с использованием микропроб ДНК (микроэр-рэй - microarray). Такой анализ позволяет сравнивать паттерны экспрессии генов в норме и при различных заболеваниях ПЖ и выявлять генные изменения, значимые для возникновения и развития РПЖ. При РПЖ были выявлены изменения уровней мРНК ТЫ5 [Bao L. et al. 1996], AGR2 [Kristiansen G. et al. 2005], MY06 [Dunn T.A. et al. 2006], TGFp, IGF1, IGFBP3 [Kawada M. et al. 2008], IGF1R [Krueckl S.L. et al. 2004], KLF6 [Chen C. et al. 2003], GH, GHR [Chopin L.K. et al. 2002], AR, KLK2, PSMA, PCA3 [Neves A.F. et al. 2008], ANXA1,2,4,7,11 [Xin W. et al. 2003], HPN, AMACR, EZH2, TCEB1, CLDN8, PRC17, S100-P, Wnt5A, PART-1, SGP28, SEPP1, GR02 [Calvo A. et al. 2005; Hughes C. et al. 2005] и мн. др. Делались попытки выявить профили генной экспрессии, корреспондирующие с прогнозом РПЖ (так называемые предиктивные, или прогностические, профили). В одном из первых таких исследований с помощью ДНК-микроэррей технологий было установлено, что при метастатическом РПЖ повышается экспрессия генов МТА1, TIMP2, THBS1 и HPN [Klezovitch О. et al. 2004]. С высоким риском прогрессирования ассоциирована пониженная экспрессия генов PTEN, MYC, CDH1 и FASN [Dhanasekaran S.M. et al. 2001]. Активация сигнального пути Wnt и снижение экспрессии гена KLF6 также коррелируют с плохим прогнозом РПЖ [Glinsky G.V. et al. 2004].
Таким образом, генетическую основу опухолевой трансформации позволяют исследовать молекулярно-генетические методы, геномные и транскриптомные технологии. К повсеместно используемым технологиям относятся ДНК-микроэррэй, ПЦР, ПЦР в режиме реального времени, флуоресцентная гибридизация in situ. С помощью этих методов можно выявить изменения ДНК, которые могут служить маркерами опухолевого процесса: генные мутации, потерю гетерозиготности, микросателлитную нестабильность и гиперметилирование ДНК, а также обнаружить потенциальные маркеры путем сравнения уровней продуктов транскрипции тысяч генов в нормальных и раковых тканях. Информация о некоторых генетических изменениях, выявленных на разных этапах канцерогенеза в тканях ПЖЧ, суммирована в Таблице 1.3.