Нуклеозид-дифосфат киназа из археона Natrialba magadii; структурно-функциональные особенности, связанные с экстремальными условиями обитания

• Автор: Полосина, Ярослава Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 126 с.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Характеристика семейства иуклеозид-дифосфат киназ
1.1. Общая характеристика
1.2. Структура НДФ киназ
1.3. Каталитический механизм
1.4. . Дополнительные функции
1.5. Физиологическое значение
1.6. Стабильность
2. Стабильность белков экстремофильных организмов
2.1. . Факторы, лимитирующие жизнеспособность организма
2.2. • Термодинамические аспекты белковой стабильности
2.3... Белки из гипертермофилов
2.4. Белки из психрофилов
2.5. Структурные детерминанты белковой стабильности
3. Галофильность...............................................Г.ТГГ

3.1. Активность белков из галофилов
3.2. Влияние соли на белковую структуру
/3.3. ‘ Аминокислотные последовательности и структуры белков из галофильных
, архей
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. МАТЕРИАЛЫ
1.1. Реактивы
1.2. Приборы
2. МЕТОДЫ
2.1. Использованные штаммы микроорганизмов и условия их роста. ..'
2.2. Приготовление клеточного экстракта
2.3. Выделение НДФ киназы
2.4. Определение концентрации НДФ киназы
25. Электрофоретический анализ
2.6. Определение молекулярного веса
2.7. Определение аминокислотного состава НДФ киназы
2.8. Определение Ы-концевой последовательности НДФ киназы
2.9. Получение антител к НДФ киназе
2.10. Иммуноблотгинг
2.11. Спектрофотометрический анализ
2.12. Ограниченный протеолиз
2.13. Анализ автофосфорилирования
2.14. Калориметрические исследования НДФ киназы
2.15. Исследование НДФ киназы методом кругового дихроизма
2.16. Измерение внутренней флуоресценции.-..*
2.17. Определение олигомерного состояния НДФ киназы с помощью гель-
фильтрации
2.18. Взаимодействие НДФ киназы с другими белками

2.18.1.Выделение жгутиков

2.18.2. Пришивка флагеллинов и других белков на СИВг-сефарозу
2.18.3.Хроматография на протеин-сефарозе ..|

2.19. Определение степени сродства НДФ киназы к различным нуклеозид-
фосфатам
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Выделение и идентификация НДФ киназы
1.1. Выделение и очистка НДФ киназы
1.2. Определение Ы-концевой последовательности
1.3. Проверка ферментативной активности
2. Физико-химические характеристики
2.1. Определение молекулярного веса и олигимерного состояния
2.2. Аминокислотный состав
2.3. Иммунологический анализ
2.4. Взаимодействие с другими белками
2.5. Аффинность к нуклеозид-фосфатам
2.6. Кристаллизация
3. Стабильность НДФ киназы в;различных условиях

3.1. Влияние лигандов и двухвалентных катионов на стабильность и активность НДФ киназы
3.1.1. Влияние лигандов
3.1.2. Влияние ионов М§+
3.2. Влияние ионной силы, температуры, денатурантов и pH на стабильность и активность НДФ киназы
3.2.1. Сохранение вторичной структуры
3.2.2. Сохранение третичной структуры
3.2.3. Сохранение четвертичной структуры
3.2.4. Сохранение активности
4. Возможный механизм сохранения активности НДФ киназы в широком диапазоне
условий
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

3. Галофильность
Галофильные микроорганизмы в изобилии встречаются в гиперсоленых водоемах, таких как Мертвое море, Великое соленое озеро, а также в солеварнях. Такие соленые водоемы часто окрашены красным из-за плотной населенности пигментированными организмами (Javor, 1989; Oren, 1993; Kamekura, 1998). Другими местами обитания галофильных и галотолерантных организмов являются засоленная еда и засоленные почвы.
Галофилы найдены во всех трех доменах - среди бактерий, архей и эукариот. Некоторые (например, бактерия Halomonas elongata) могут адаптироваться к существованию в широком ранге концентрации соли, другие, такие как археи из рода Halobacteriacea, адаптированы к жизни в солевых условиях, близких к насыщенным, и не могут жить при концентрации соли ниже 2.5 М.
Галофильные археи - это пигментированные, аэробные или факультативно анаэробные органотрофы, которые найдены в природе в гиперсоленых источниках (Kates et al., 1993; Rodriguez-Valera, 1998). Такое окружение включает естественные соленые и содовые озера, а также солеварни, где концентрация NaCl может достигать 6 М, с добавлением до 1.5 М Mg2+ и до 0.1 М К+. Некоторые из этих галофильных архей живут при нейтральных значениях pH, тогда как другие требуют щелочных условий (pH 9-10) и ограничиваются пересыхаемыми содовыми озерами с большим количеством Na2C03 (Grant & Tindall, 1986).
Две фундаментально различные стратегии доступны микроорганизмам
для борьбы с осмотическим стрессом. Одна из этих стратегий, реализуемая
большинством галофильных бактерий, эукариотическими водорослями и грибами, а
также галофильными метаногенными археями, базируется на сохранении низкой
концентрации соли в цитоплазме за счет повышения концентрации других
компонентов. Органические осмотические компоненты обеспечивают осмотический
баланс и позволяют функционировать соленеадаптированным ферментам. Примерами
таких компонентов являются глицерин (у Dunaliella и некоторых грибов), бетаин
глицерина (у галофильных фотосинтезирующих бактерий) и эктоин (синтезируется
многими автотрофными и гетеротрофными бактериями) (Galinski, 1995). Эти