Ингибирование теломеразы человека

• Автор: Ажибек, Дулат Мейирбекович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 142 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Введение в обзор литературы

1.2 Иммунотерапия

1.3 Генная терапия

1.4 Ингибирование работы теломеразы

1.4.1 Методы измерения теломеразной активности

1.4.1.1 ТРАП анализ

1.4.1.2 Устранение ингибирования ПЦР
1.4.1.3/и у/уо ТРАП
1.4.2 Низкомолекулярные вещества и Иметелстат
1.5 Ингибирование биогенеза теломеразы
1.5.1 Ингибирование транскрипции ЬТЕЯТ
1.5.2 Ингибирование пострансляционной модификации ЬТЕЯТ
1.5.3 Уменьшение доступности теломер для теломеразы
1.5.4 Олигонуклеотиды для ингибирования теломеразы
1.5.4.1 Применение олигонуклеотидов, взаимодействующих с мРНК ЬТЕЯТ
1.5.4.2 Воздействие олигонуклеотидных ингибиторов теломеразы на ЬТЯ
1.5.4.3 Олигонуклеотидные ингибиторы, нарушающие сборку теломеразы
1.6 Заключение

2 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
2.1 Разработка метода детекции теломеразной активности
2.1 Л Очистка теломеразного экстракта
2.1.2 Устранение ингибирования ПНР
2.1.3 Проверка метода на низкомолекулярных 04-квадруплекс лигандах
2.1.4 Ингибирование теломеразы новым металлорганическим соединением, содержащим медь
2.1.5 Рекомбинантная экспрессия теломеразы и вальпроевая кислота.
2.2 Разработка новых подходов к ингибированию теломеразы
2.2.1 Дизайн химерных бифункциональных олигонуклеотидов
2.2.2 Ингибирование теломеразы химерными олигонуклеотидами in vitro.
2.2.3 Ингибирование теломеразы химерными олигонуклеотидами in vivo_
2.2.3.1 Проверка ингибирования ПЦР для in vivo ТРАП метода
2.2.3.2 Стабильность химерных олигонуклеотидов в клеточых линиях и защита 5’-конца
2.2.3.3 Длина и расположение линкера
2.2.3.4 Специфичность химерных олигонуклеотидов
2.2.3.5 Токсичность химерных олигонуклеотидов
2.2.3.6 Уровень теломеразной РНК в системе in vivo в присутствий
химерных олигонуклеотидов
2.2.3.7. Сборка теломеразного комплекса в присутствии химерных олигонуклеотидов в условиях in vivo
2.3 Заключение
3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1 Реактивы и биопрепараты.

3.2 Получение S100 экстракта
3.3 Проверка деградации олигонуклеотида в S
3.4 ТРАП с визуализацией в полиакриламидном геле («Классический» ТРАП)
3.5 Клонирование
3.5.1 Получение конструкций для рекомбинантной экспрессии теломеразы
3.5.2 ПЦР
3.5.3 Разделение фрагментов ДНК в агарозном геле
3.5.4 Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля
3.5.5 Приготовление векторов и вставок
3.5.6 Приготовление компетентных клеток E. coli
3.5.7 Трансформация компетентных клеток E. coli
3.5.8 Выделение плазмидной ДНК для клонирования
3.6 Выделение плазмидной ДНК для трансфекции в эукориотические клеткиЮб
3.7 Трансфекция плазмид в эукариотические клетки для анализа и обработка вальпроевой кислотой (ВПА)
3.8 Экспрессия и очистка теломеразы
3.9 Метод измерения ингибирования теломеразы in vitro (RQ-ТРАП)
3.10 Прямой метод измерения теломеразной активности
3.111 Введение радиоактивной метки на 5'-конец олигонуклеотида 15bpLCl
3.12 Трансфекция клеток ингибиторными олигонуклеотидами и получение клеточного экстракта
3.13 In vivo RQ-ТРАП

1.5.2. Ингибирование посттрансляционной модификации ЬТЕИТ
Известно, что теломеразная обратная транскриптаза ЬТЕЯТ фосфорилируется и это необходимо для активности и клеточной локализации теломеразы [86]. Следовательно, фосфатазные и киназные ингибиторы могут непосредственно влиять на теломеразу. Например, окадаевая кислота (рис. 16) является ингибитором фосфатазы 2А. Известно, что фосфатаза 2А ингибирует теломеразу. Обработка клеточной линии опухоли молочной железы окадаевой кислотой приводила к активации теломеразы [87].
Рис. 16. Структурные формулы веществ, ингибиторов фосфатазы (верхний ряд) и тирозинкиназ (нижний ряд).
Протеин киназа С (РКС) увеличивает теломеразную активность в некоторых типах опухолевых клеток. Использование ингибитора этого фермента бисиндолилмалеимида (рис. 16) привело к ингибированию теломеразы в клетках назофарингеальной карциномы [88]. В работе [89]