Исследование новых растительных липид-транспортирующих белков

• Автор: Мельникова, Дарья Николаевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 124 с. : ил.

Оглавление
1. Введение
2. Многообразие и функции растительных белков, связывающих и переносящих липиды (обзор литературы)
2.1. Липиды и их функции в клетке
2.1.1. Растительные липиды, их синтез и локализация
2.1.2. Функции липидов в растительной клетке
2.1.3. Изменение липидного состава в течение жизненного цикла растений
2.1.4. Транспорт липидов
2.2. Белки, связывающие и переносящие липиды
2.2.1. Общая характеристика
2.2.2. Пуроиндолины
2.2.3. Стерин-переносящие белки
2.2.4. Гликолипид-переносящие белки
2.2.5. Ацил-КоА-связываюгцие белки
2.2.6. Гомологи Bet V 1
2.2.7. Липид-транспортирующие белки
2.3. Возможности практического применения растительных белков,
связывающих и переносящих липиды
3. Материалы и методы
3.1. Оборудование
3.2. Реактивы и расходные материалы
3.3. Методы
3.3.1. Выделение LTP из укропа
3.3.2. SDS-электрофорез
3.3.3. Электроблоттинг
3.3.4. Масс-спектрометрический анализ
3.3.5. Определение N-концевой аминокислотной последовательности
3.3.6. Триптический гидролиз
3.3.7. Выделение суммарной РНК
3.3.8. Обратная транскрипция и амплификация концов кДНК (RACE)
3.3.9. Клонирование и секвенирование продуктов ПЦР

3.3.10. Гетерологичная экспрессия LTP
3.3.11. Выделение и очистка гибридных белков
3.3.12. Выделение и очистка рекомбинантных LTP
3.3.13. Спектроскопия кругового дихроизма
3.3.14. Иммуноблоттинг
3.3.15. Непрямой иммуноферментный анализ
3.3.16. Определение антимикробной активности
3.3.17. Флуоресцентная спектроскопия
4. Результаты и обсуждение
4.1. Выделение и структурная характеристика нового липид-транспортирующего белка Ag-LTP
4.2. Гетерологичная экспрессия и очистка липид-транспортирующих белков
4.3. Биотехнологический способ получения LC-LTP2, тотально меченного стабильным изотопом l5N
4.4. Характеристика биологической активности Ag-LTP и Lc-LTP2
5. Выводы
6. Благодарности
7. Библиографический список
8. Список сокращений

1. Введение
Растительные липиды и их производные являются мультифункциональными соединениями и принимают участие в биогенезе мембран, дифференцировке клеток, межклеточной и внутриклеточной сигнализации, создании водоотталкивающих и термоизоляционных покровов, защищающих растение от механического повреждения, воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды и проникновения патогенной микрофлоры, а таюке выполняют запасающую и энергетическую функции. Важную роль в метаболизме липидов у растений и животных играют белки, связывающие липидные молекулы и обеспечивающие их внутри- и внеклеточный транспорт. В растениях обнаружено несколько классов белков, выполняющих разнообразные функции, но обладающих общим свойством -способностью связывать и переносить липиды и их производные. Один из наиболее функционально значимых классов подобных белков составляют липид-транспортирующие белки (Lipid Transfer Proteins или сокращенно LTP).
LTP - небольшие катионные белки, обладающие способностью обратимо связывать и переносить гидрофобные молекулы in vitro. LTP растений относительно стабильны, хорошо растворимы в воде, устойчивы к тепловой и химической денатурации, а таюке к действию протеолитических ферментов. Данные белки участвуют во многих биологических процессах в растениях, таких как биосинтез кутина, эмбриогенез, адаптация растений к действию стрессогенных факторов окружающей среды. Предполагается, что LTP, подавляющие рост фитопатогенных бактерий и грибов, являются важным элементом защитной системы растений.
Изучение LTP растений представляет большой интерес в связи с возможностью их практического применения в сельскохозяйственной отрасли для борьбы с фитопатогенными микроорганизмами и насекомыми-вредителями. Использование методов ротационного земледелия и традиционной селекции, направленных на получение устойчивых культур, а таюке применение

ACBP2 и АСВР4 наблюдается в корнях - основном месте внедрения патогенов и поступления тяжелых металлов. Все эти данные в совокупности свидетельствуют в пользу участия данных белков в реализации защитных механизмов растения [44; 107].
В экспериментах in vitro было показано, что АСВР4 и АСВР5 обладают большим сродством к ацил-КоА с углеводородной цепью 18:1, чем АСВР6, также локализованный в цитозоле. Предполагается, что именно АСВР4 и АСВР5 выполняют перенос этого ацил-КоА в цитозоле между пластидами и ЭР [285]. Кроме того, данные белки связывают фосфолипиды, что не позволяет исключить возможность их участия в переносе этих липидов в клетках растений [281].
2.2.6. Г омологн Bet v
Растения постоянно подвергаются воздействию различных патогенов, насекомых-вредителей и абиотических стрессогенных факторов окружающей среды. В связи с отсутствием у растений адаптивной иммунной системы в их арсенале находится целый ряд врожденных защитных механизмов, включая гиперчувствительный ответ, утолщение клеточной стенки, повышение концентрации фитогормонов, развитие локальной и системной приобретенной резистентности, в том числе за счет синтеза белков, связанных с патогенезом (Pathogenesis-Related Proteins или PRP), и вторичных метаболитов, обладающих антимикробным действием. На сегодняшний день на основании сходства структуры и функций PRP подразделяют на 17 классов [237; 265].
Представители класса PRP-10, которых также называют гомологами Bet vl, имеют молекулярную массу около 16-18 кДа, изоэлектрическую точку в кислой области pH и устойчивую к протеолизу структуру. В отличие от большинства PRP представители PRP-10 синтезируются без соответствующей сигнальной последовательности и функционируют в цитозоле [171]. Первый белок данного класса, названный Bet vl, был выделен из водного экстракта пыльцы березы Betula verrucosa и охарактеризован как сильный аллерген [131].