Катионные α-спиральные олигопептиды - носители ДНК

• Автор: Гурьянов, Иван Алексеевич
• Шифр специальности: 02.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 126 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Список используемых в тексте сокращений и терминов
1 ВВЕДЕНИЕ
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 Молекулярная структура белков и олигопептидов

2.1.1 Взаимодействие амфипатических олигопептидов
с мембранами
2.2 Проникновение невирусных векторов в клетку
2.2.1 Комплексообразование и компактизация ДНК
2.2.2 Связывание с поверхностью клетки
(0 2.2.3 Транспорт в ядро клетки
2.3 Носители ДНК в генной терапии
2.3.1 Использование катионных липидов в качестве
носителей ДНК
2.3.2 Катионные полимеры как носители ДНК
2.3.3 Использование катионных олигопептидов как
носителей ДНК
3 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1 Синтез пептидов
3.1.1 Синтез пептидов БР, БР1 и БР
3.1.2 Синтез пептидов N2 и Ш
3.1.3 Синтез пептидов N4 и ЯШ
3.2 Изучение вторичной структуры пептидов методом
кругового дихроизма

~ 3.3 Исследование структуры и размеров комплексов
синтезированных пептидов с ДНК методом
электронной микроскопии
3.4 Исследование комплексообразования и защиты ДНК от нуклеазного расщепления методом
гель-электрофореза
3.5 Исследование гемолитической активности пептидов
3.6 Исследование эндосомолитических свойств пептидов

FP1 и FP
3.7 Взаимодействие пептидов с аденилатциклазной
системой клетки
4 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
щ 4.1 Материалы
4.2 Оборудование
4.3 Методы
4.3.1 Синтез пептидов FP, FP1, FP4, JTS-1, N2, RN2, N4, RN4
4.3.2 Спектроскопия кругового дихроизма
4.3.3 Электронная микроскопия комплексов
пептид-ДНК
4.3.4 Получение комплексов пептид-ДНК и изучение
их устойчивости к ферментативному расщеплению методом гель-ретардации (DNase I protection assay)
4.3.5 Определение гемолитической активности
4.3.6 Оценка эффективности трансфекции комплексами
пептид pCMV-nlsLacZ
4.3.7 Изучение влияния пептидов на аденилатциклазную
систему

5 ВЫВОДЫ
6 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Приложение 1 а-Аминокислоты, входящие в состав белков

2) Гистоноподобные катионные белки, связанные нековалентно с ДНК, могут способствовать проникновению в ядро.
3) В некоторых случаях вирусы используют для этой цели гистоны клетки-хозяина. Вирусная ДНК в этом случае содержит последовательности, которые связываются с нуклеопротеинами клетки-хозяина.
Исследование механизмов проникновения вирусной ДНК в ядро может существенно помочь в создании невирусных носителей чужеродной ДНК, особенно в неделящиеся клетки. Было показано, что введение в них сигналов ядерной локализации увеличивает экспрессию в сотни раз. Однако в этом случае нужно учитывать ряд факторов, в том числе и размер комплекса. Так [66], в случае использования полилизина (с молекулярной массой 110 ООО) с ковалентно связанным с ним NLS, влияние сигнала ядерной локализации можно было наблюдать только до соотношения носитель/ДНК 4,0. При этом соотношении размер комплекса резко уменьшался и, вследствие достаточной гибкости, мог свободно диффундировать через ядерные поры.
Олигомеризация сигналов ядерной локализации и введение в структуру носителя нескольких пептидных последовательностей, способствующих транспорту комплекса ДНК-носитель в ядро клетки, приводит к резкому увеличению экспрессии ДНК [67]. Например, при использовании тетрамера NLS вируса SV40 (SV40 large T-antigen) экспрессия ДНК увеличивалась в 100 раз, по сравнению с мономерным сигналом ядерной локализации [68].
2.3 Носители ДНК в генной терапии.
Различные носители ДНК для невирусного переноса генов in vitro и in vivo можно разделить на 3 группы:
1) катионные липиды,
2) синтетические полимеры (включая дендримеры, полиэтиленимины, полиамидоамины,полилизины),