Электрохимические ДНК-сенсоры на основе полиэлектролитных комплексов и наноразмерных медиаторов электронного переноса

• Автор: Степанова, Вероника Борисовна
• Шифр специальности: 02.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 126 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ
1 ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ ДНК-СЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ ЭЛЕКТРОПОЛИМЕРИЗОВАННЫХ И НАНОРАЗМЕРНЫХ МАТЕРИАЛОВ (Литературный обзор)

1.1 Общая характеристика электрохимических ДНК-сенсоров

1.2 Электрохимические ДНК-сенсоры на основе полиэлектролитных комплексов

1.3 Определение ДНК-повреждающых факторов

1.4 Аптасенсоры на основе электрополимеризованных и малоразмерных материалов

2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1 Материалы и реагенты

2.2 Приборы и оборудование

2.3 Изготовление ДНК-сенсоров
2.3.1 Приготовление растворов
2.3.2 ДНК-сенсор на основе полиэлектролитного комплекса.
2.3.3 Аптасенсор на основе наноразмерных медиаторов электронного переноса на макроциклической платформе
3 ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ ДНК-СЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ КОМПЛЕКСОВ ДНК
3.1 Характеристика условий получения и электрохимической активности полимерных форм МС и М3 на стеклоуглеродном электроде
3.2 Формирование полиэлектролитных комплексов с участием полифенотиазинов
3.3 Влияние повреждения ДНК на характеристики электрохимического импеданса полиэлектролитных комплексов ДНК
4 АПТАСЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ НАНОРАЗМЕРНЫХ МЕДИАТОРОВ ЭЛЕКТРОННОГО ПЕРЕНОСА
4.1 Функционализация поликарбоксилированных тиакаликсаренов НК
4.2 Вольтамперометрическое определение тромбина
4.3 Импедиметрическое определение тромбина
5 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОХРАТОКСИНА А И АУТОИММУННЫХ АНТИТЕЛ К ДНК
5.1 Определение охратоксина А
5.2 Определение аутоиммунных антител к ДНК
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ БИБЛИОГРАФИЧЕСКИХ ИСТОЧНИКОВ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ACM - атомно-силовая микроскопия;
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;
М3 - Метиленовый Зеленый;
МС - Метиленовый Синий;
НК - Нейтральный Красный;
Поли-МЗ - полимерная форма Метиленового Зеленого;
Поли-МС - полимерная форма Метиленового Синего;
Поли-НК - полимерная форма Нейтрального Красного;
ТКА - поликарбоксилированный тиакаликс[4]арен; трис - трис(гидроксиметил)аминометан;
ЭДТА-этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль; с - концентрация, нМ, мкМ и мМ;
C|lm - предел обнаружения, М или мг/л;
С - емкость поверхностного слоя, мкФ;
СРЕ - постояннофазовый элемент (constant phase element);
Е - потенциал электрода или ДНК-сенсора, мВ;
EDC - І-зтил-З-(З-диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлорид; HEPES - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновую кислота; MES - 2-(А-морфолино)этансульфоновая кислота;
NHS -А-гидроксисукцинимид;
РАН - поли(аллиламин гидрохлорид);
PSS - полистиролсульфонат;
Re/ — сопротивление переноса заряда, кОм.

Аптамерами называют однонитевые олигонуклеотиды, которые при определенных внешних условиях (pH, ионная сила, наличие низкомолекулярных соединений) способны к самопроизвольному образованию трехмерных структур, содержащих высокоспецифичный центр связывания аналита. В некоторых случаях специфичность связывания аптамер - аналит сопоставима или превосходит таковую для иммунохимических взаимодействий, что позволяет называть аптамеры «искусственными антителами» [127]. В отличие от большинства других электрохимических сенсоров, использующих производные нативной ДНК, аптамеры не имеют природных аналогов и чаще являются структурными производными РНК, а не ДНК. Последнее связано с технологией получения аптамеров.
Аптамеры впервые были синтезированы в начале 1990-х годов тремя независимыми группами ученых [128, 129]. В настоящее время данная технология известна как SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). Наиболее распространенные аптамеры для определения белков содержат 30-60 нуклеотидов. Их комплексы с аналитами характеризуются константой диссоциации на уровне 1-100 нМ. Аптамеры часто модифицируют для облегчения их включения в состав аналитических устройств путем введения концевых групп -SH, -NH2, биотина и др. [130]. Аптамеры сохраняют способность к гибридизации с комплементарными участками других олигонуклеотидов, что позволяет создавать сложные молекулярные устройства с расширенными функциями распознавания [131]. Также распространены композитные материалы, сочетающие аптамеры с наночастицами металлов, углеродными нанотрубками, графеном, которые выполняют те же функции, что и в составе традиционных ДНК-сенсоров (основа для иммобилизации аптамеров и генерирование аналитического сигнала, связанного с переносом электрона на метки и индикаторы) [132].
Значительное число публикаций посвящено аптасенсорам для определения а-тромбина из сыворотки крови человека. Это сериновая протеаза, которая определяет скорость коагуляции крови за счет контроля превращения растворимого фибриногена в нерастворимый фибрин. В медицинской практике анализ тромбина имеет значение в пред- и послеоперационный период при полостных операциях, а также для выявления предрасположенности пациента к тромбозу. Интерес к аптасенсорам на тромбин обусловлен еще гг тем, что они стали испытательной площадкой при разработке новых спо-