Структурная основа механизма ферментативной активности нуклеозидфосфорилазы из Salmonella typhimurium

• Автор: Павлюк, Богдан Филиппович
• Шифр специальности: 01.04.18
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 112 с. : ил.

Список сокращений:

Глава 1. Литературный обзор

1.1 онкологические заболевания и методы химиотерапии опухолевых процессов основанные на применении аналогов пуринов и пиримидинов

1.2 основные классы ингибиторов пиримидиновых фосфорилаз

1.3 медицинское применение ингибиторов уридинфосфорилазы в химиотерапии опухолей

1.4 медицинское применение ингибиторов уридинфосфорилазы, как антибактериальных и противопаразитических препаратов

1.5 механизмы фосфоролиза на основании структурных и кинетических данных

1.6 Общая характеристика нуклеозидфосфорилаз

1.6.1 нуклеозидфосфорилазы состоящие из одного домена

1.6.2 нуклеозидфосфорилазы состоящие из двух доменов

1.6.3 рентгеноструктурные исследования

1.6.4. структурная организация активного центра
1.7 заключение
Глава 2. Материалы и методы
2.1 методы кристаллизации белков и комплексов на их основе
2.1.1 получение комплексов белков в кристаллах
2.2 программное обеспечение для решения, уточнения структуры и проверки качества полученных данных
2.2.1 решение структуры методом молекулярного замещения
2.2.2 программное обеспечение, используемое при уточнении структуры
2.2.3 проверка качества решения структуры, критерии правильности решения структуры...
Глава 3. Экспериментальная часть
3.1 материалы
3.1.1 химические материалы
3.1.2 биологические материалы
3.2 методы
3.2.1 выделение и очистка уридинфосфорилазы Salmonella typhimurium
3.2.2 выращивание кристаллов уридинфосфорилазы S. typhimurium в свободном и лигандированном состояние
3.2.3 получение наборов дифракционных данных

3.2.4 решение и уточнение структур уридинфосфорилазы 5. [урЫтигшт в свободном и
связанном состояниях
Глава 4. Результаты и обсуждение
4.1 получение гомогенного препарата уридинфосфорилазы 5.1урЫтипит
4.2 кристаллизация уридинфосфорилазы Б. 1урЫтигшт
4.3 кристаллизация уридинфосфорилазы 8.(урЫтигшт в комплексе с аналогами субстратов
4.4 Сбор рентгенодифрационных данных с полученных кристаллов, решение и уточнение структур
4.5 пространственная организация фермента в свободном и лигандированном состоянии
4.6 влияние ионов калия
4.7 активный центр фермента ЗШРЬ
4.7.1 нуклеозид-связывающий сайт
4.7.2 фосфат-связывающий сайт
4.8 сравнительный структурный анализ свободного и лигандированного фермента
Основные результаты и выводы:
Список литературы
Благодарности
Список сокращений:
• РНК - рибонуклеиновая кислота.
• ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота.
• 5FUra - 5-Флюороурацил (5-фторурацил, C4H3FN20), 5-Фтор-2,4-(1Н,ЗН)-пиримидиндион.
• FUrd - 5-фторуридин.
• АМФ(АМР) - аденозин-5 ’-монофосфат.
• ГМФ(ОМР)-гуанозин-5’-монофосфат.
• УМФ(иМР) - уридин-5 ’-монофосфат.
• ЦМФ - цитидин-5’-монофосфат.
• ТМП - тимидин-5 ’ -монофосфат.
• ОМФ - оротидин-5'-монофосфат.
• PRPP - фосфорибозилдифосфат.
• ИМФ - инозин-5'-монофосфат.
• УДФ - уридина дифосфат.
• ГДФ - гуанозина дифосфат.
• ЦДФ - цитидина дифосфат.
• АТ Ф - аденозина трифосфат.
• ГТФ - гуанозина трифосфат.
• НАД+ - никотинадениндинуклеотид.
• НАДФ+ - никотинадениндинуклеотида фосфат.
• ФАД(РАБ) - флавинадениндинуклеотид.
• ФМН(РМЫ) - флавинмононуклеотид.
• Ura - урацил.
• Sn - реакция нуклеофильного замещения.
• PDB - Protein Data Bank - банк белковых структур RCSBI.
• NP - нуклеозидфосфорилазы.
• У Фаза, UP - уридинфосфорилаза.
• PNP - пуриновая нуклеозидфосфорилаза.
• ANEUR - 2,2’-ангидро-5-этилуридин.
• ANU - 2,2’-ангидроуридин.
• MAD - метод аномального рассеяния.
• МНК - метод наименьших квадратов.

различных диапазонах по концентрации и значении pH. Раствор белка можно смешивать с противораствором как 1:1, так и варьировать это соотношение. В случае если начальный эксперимент по кристаллизации проводился в стандартных условиях и образование кристаллов или аморфной преципитации в течение 2-х недель не наблюдалось, то можно перенести капли в термостатируемое помещение и продолжить эксперимент при 4 °С.
Часть методов, используемых для выращивания белковых кристаллов, разработана уже давно. Использование других, началось сравнительно недавно, но в настоящее время находит все большее применение. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки, и выбор того или иного метода кристаллизации зависит от конкретных условий и опыта исследователя. Основными и наиболее часто используемыми методами кристаллизации белков являются:
1) кристаллизация в объеме;
2) кристаллизация диализом;
3) кристаллизация методом диффузии паров растворителя;
4) кристаллизация в геле;
5) кристаллизация в невесомости;
6) кристаллизация в центрифуге;
7) кристаллизация на подложке.
2.1.1 получение комплексов белков в кристаллах
Наиболее часто для получения кристаллов комплексов белков с субстратом (ингибитором, продуктом реакции или же их аналогами) используют метод сокристаллизации и (или) настаивания. Выбор метода определяется исходя из специфики фермента, субстрата и данных по кинетике биохимической реакции.
В случае сокристаллизации, субстрат (ингибитор, продукт реакции или его аналог) добавляют в эквимолярных количествах по отношению к белку на начальном этапе кристаллизации в процессе смешивания раствора белка с