Пространственная структура медных полиядерных оксидаз - лакказ Coriolus zonatus и Cerrena maxima

• Автор: Ляшенко, Андрей Владимирович
• Шифр специальности: 01.04.18
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 168 с. : ил.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Полимедные голубые белки
1.2. Пути эволюции полимедных голубых белков (ПМГБ)
1.3. Медьсвязывающие сайты ПМГБ
1.4. Трехдоменные ПМГБ
1.5. Лакказы
1.5.1. Белая лакказа
1.5.2. Лакказы насекомых
1.5.3. Малые грибные лакказы
1.6. Реакции, катализируемые лакказами
1.7. Биологическое распространение и функция лакказы
1.8. Химический состав фермента
1.8.1. Выделение лакказы
1.8.2. Молекулярная масса и аминокислотная последовательность
1.8.3. Содержание углеводов
1.8.4. Содержание металла и три типа ионов меди
1.8.5. Обратимое удаление меди
1.9. Спектроскопические и магнитные свойства лакказ
1.9.1. Оптические спектры
1.9.2. Исследования рентгеновской абсорбции
1.9.3. Магнитная восприимчивость
1.10. Окислительно- восстановительные свойства
1.11. Каталитическая реакция
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. МАТЕРИ АЛЫ
2.1.1. Биологические материалы
2.1.2. Химические материалы
2.1.3. Носители
2.2. МЕТОДЫ
2.2.1. КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ БИОМАКРОМОЛЕКУЛ
2.2.2. Метод молекулярного замещения
2.2.3. Уточнение атомной структуры
2.2.4. Корректность решённой структуры
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1. Получение препаратов лакказ
3.1.1. Выращивание гриба Corioluszonatus в колбах
3.1.2. Очистка лакказы Coriolus zonatus
3.1.3. Поверхностное культивирование Cerrena maxima
3.1.4. Глубинное культивирование Cerrena maxima
3.1.5. Очистка лакказы Cerrena maxima
3.2. Кристаллизация лакказ
3.2.1. Кристаллизация лакказы Coriolus zonatus
3.2.2. Кристаллизация лакказы Cerrena maxima
3.3. Получение наборов рентгенодифракционных данных
3.3.1. Набор интенсивностей дифрагированных кристаллом лакказы
Coriolus zonatus
3.3.2. Экспериментальный набор интенсивностей дифрагированных
кристаллом лакказы Cerrena maxima
3.4. Построение стартовой модели

3.4.1. Построение стартовой модели структуры лакказы Coriolus zonatus
3.4.2. Построение стартовой модели структуры лакказы Cerrena maxima
3.5. Уточнение структуры
3.5.1. Уточнение структуры лакказы Coriolus zonatus
3.5.2. Уточнение структуры лакказы Cerrena maxima
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Получение биоматериала для выделения лакказы Coriolus zonatus
4.2. Выделение лакказы Coriolus zonatus
4.3. Получение биомассы для выделения лакказы Cerrena maxima
4.3.1. Поверхностное культивирование Cerrena maxima
4.3.2. Глубинное культивирование Cerrena maxima
4.4. Очистка лакказы Cerrena maxima
4.5. Кристаллизация лакказы
4.5.1. Кристаллизация лакказы Coriolus zonatus
4.5.2. Кристаллизация лакказы Cerrena maxima
4.6. Получение дифракционных данных с кристаллов лакказы
4.6.1. Получение наборов дифракционных данных от кристаллов
лакказы Coriolus zonatus
4.7. Построение стартовой модели для решения и уточнения структуры
лакказы Coriolus zonatus с разрешением 3.2 А
4.8. Получение наборов дифракционных данных от кристаллов лакказы
Cerrena maxima
4.9. Построение стартовой модели для решения и уточнения структуры
лакказы Cerrena maxima
4.10. Уточнение структуры лакказы Coriolus zonatus
4.11. Уточнение структуры лакказы Cerrena maxima
4.12. Первичная структура молекул лакказ
4.13. Пространственная организация молекул лакказ
4.14. Структура активного центра
4.15. Водные каналы
4.16. Углеводная компонента лакказы Cerrena maxima
4.17. Особенности пространственной структуры Cerrena maxima
4.18. Предполагаемый механизм действия фермента
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ

Ферментативные реакции, протекающие с восстановлением молекулярного кислорода до воды, могут осуществляться лишь небольшим кругом ферментов, к которому относится лакказа. Лакказа (кислород-оксидоредуктаза, ЕС 1.10.3.2) - фермент, принадлежащий семейству «голубых» мультимедийных оксидаз, которое включает помимо лакказы аскорбатоксидазу и церулоплазмин. Лакказа катализирует окисление различных соединений, включая орто- и пара-дифенолы, полифенолы, лигнины, полиамины и арилдиамины, а также некоторые неорганические ионы с сопутствующим восстановлением молекулярного кислорода до воды [1-3]. Благодаря разнообразию реакций, катализируемых лакказами, эти ферменты являются перспективными для их широкого использования в различных технологических процессах. Интерес к изучению этого фермента обусловлен также возможностью его широкого применения в биотехнологии, в том числе и для создания биосенсоров различного типа, а также альтернативных источников тока. Феномен прямого переноса электрона является теоретической базой для создания биосенсоров, могущих стать основой для создания нанобиоустройств с высокой эффективностью электронного транспорта, достаточной для нормального функционирования микробиочипов и микроманипуляторов [4, 5]. Лакказы из растений и грибов из-за их оксидазной активности вовлечены в процессы биодеградации лигнинов, которые играют значительную роль при переработке отходов на земле. Все это стимулирует фундаментальные научные исследования лакказ, т.к. для эффективного применения фермента необходимо знание механизма его действия, а, следовательно, кинетических и электрокаталитических свойств, а также пространственной организации белковой молекулы, её каталитического центра. Установление структурно-функциональной взаимосвязи является чрезвычайно актуальным для понимания принципов организации и функционирования медьсодержащих оксидаз. Лакказы из

Для автоматизации опытов по кристаллизации белков созданы специальные установки и роботы, управляемые компьютером и позволяющие контролировать и анализировать экспериментальные результаты. Они программируются на последовательное разбавление растворов, помещение растворов в кристаллизационные ячейки, перенос определенного объема резервуарного раствора на силиконированные стекла и добавление белка в каплю, где происходит кристаллизация. В настоящее время сконструировано несколько автоматических систем для проведения экспериментов по кристаллизации [126, 130, 162 - 165]. Высокая точность определения объемов и концентраций подтверждается высокой воспроизводимостью результатов. Одна из таких систем позволила одновременно проводить 14 независимых экспериментов, точно изменяя в растворах содержание шести компонентов по заранее заданной программе. В итоге из 14 белков 8 были закристаллизованы в течение полугода [166].
В последнее время получили развитие системы видеозаписи процесса образования и роста кристаллов [162]. Доступность информации о механизме роста белковых кристаллов, образовании кристаллических агрегатов и полиморфных кристаллов, возможность простого измерения скоростей роста позволяют планировать новые эксперименты и управлять процессами роста. Огромные перспективы, связанные с использованием автоматизированных кристаллизационных систем, очевидны.
2.2.2. Метод молекулярного замещения
Основной идеей решения проблемы фаз методом молекулярного замещения является использование известной структуры гомологичной молекулы (белка, РНК или ДНК) в качестве модели для получения начального приближения набора фаз. При этом предполагается, что гомология аминокислотных последовательностей двух молекул обеспечивает схожесть их пространственных структур. Это предположение не является строго обоснованным, однако, на практике, при достаточно высокой степени