Химические реакции кинуренина и его производных - молекулярных УФ-фильтров хрусталика

• Автор: Копылова, Людмила Владимировна
• Шифр специальности: 01.04.17
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 124 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Введение
Глава I. Обзор литературы
1.1. Строение и состав хрусталика
1.2. Белки хрусталика - кристаллины
1.3. Низкомолекулярные соединения в хрусталике
1.3.1. Антиоксиданты в хрусталике: глутатион и аскорбат
1.3.2. Триптофан и его метаболиты
1.3.3. Хрусталик и ультрафиолетовое (УФ) излучение
1.3.4. Функции УФ-фильтров
1.4. Кинуренины: фотохимические реакции
1.4.1. Фотостабильность кинуренина и его производных
1.4.2. Фотолиз кинуренина
1.4.3. Тушение триплетного состояния кинуренина
1.5. Кинуренины: термические реакции
1.5.1. Дезаминирование и декарбоксилированис
1.5.2. Циклизация
1.5.3. Автоокисление ЗОНКМ
1.5.4. Присоединение к аминокислотным остаткам белков
1.6. Катаракта у подопытных животных
1.7. Постановка задачи
Глава II. Экспериментальная часть
2.1. Материалы и реактивы
2.2. Синтезы
2.2.1. Синтез дезаминированного кинуренина (СКА)
2.2.2. Синтез аддуктов кинуренина с аминокислотами и антиоксидантом глутатионом
2.3. Инкубирование
2.3.1. Образование аддуктов
2.3.2. Разложение аддуктов
2.3.3. Разложение КИ и ЗОНКИ
2.4. Выделение небелковых экстрактов из хрусталиков
2.5. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)
2.6. Кинетическая оптическая спектроскопия
2.7. Определение концентрации белка в растворе с использованием метода Бредфорда
2.8. Определение концентрации свободных тиолов с использованием реактива Эллмана
2.9. Масс-спектрометрия
2.10. Статистическая обработка результатов
Глава III. Дезаминированный кинуреппн и его реакции с биологическими молекулами. Стабильность аддуктов
3.1. Введение
3.2. рН-зависимость реакции разложения КТ4 и ЗОНЮЧТ
3.3. Механизм дезаминирования
3.4. Выделение продуктов термолиза КЫ
3.5. Определение констант скорости реакций СКА с аминокислотами и антиоксидантами
3.6. Кинетическая оптическая спектроскопия. Определение констант скорости взаимодействия СКА с глутатионом (СБН) и цистеином (Суя)
3.7. Разложение аддуктов КМ-Ьуя, КМ-Нія, КЫ-Суя, КІЧ-ОБН
3.8. Анализ кинетических зависимостей
3.9. Заключение
Глава IV. Фотофнзические свойства кинуренина, связанного с биологическими молекулами
4.1. Введение
4.2. Синтез аддуктов К1Ч с аминокислотами и антиоксидантом глутатионом
4.3. Модифицирование модельного белка лизоцима молекулами кинуренина
4.4. Масс-спектры исходного (НЕХУЬ) и модифицированного (тНЕУЕ) лизоцима
4.5. Анализ спектров оптического поглощения и масс-спектров НЕУЬ и тНЕХУЬ—
4.6. Фотохимия и фотофизика кинуренинов
4.6.1. Оптическая спектроскопия аддуктов
4.6.2. Ультрабыстрая динамика возбужденных состояний КЫ-Еуя, КЫ-Суя,
КЫ-Шя и КМ-ОБН
4.6.3. Фотофнзические свойства аддуктов КМ-Ьуя. КЫ-Суя, КМ-Нія, КИ-ОБН
4.6.4. Ультрабыстрая динамика возбужденного состояния тНЕи'Ь
4.6.5. Лазерный импульсный фотолиз шНЕ>УЪ
4.6.6. Фотофизические и фотохимические свойства лизоцима, модифицированного кинуренином
4.7. Заключение
Глава V. Триптофан и кинуренин в хрусталиках экспериментальных животных
5.1. Введение
5.2. Небелковые экстракты из хрусталиков крыс
5.3. Уровень триптофана (Тгр) в хрусталиках крыс линий Вистар и ОХУв
5.4. Уровень кинуренина (КЫ) в хрусталиках крыс линий Вистар и ОХУ
5.5. Возрастная зависимость уровня Тгр и в хрусталиках крыс линий Вистар иОХУв
5.6. Заключение
Выводы
Список литературы
Приложение

УФ-фильтры [149]. Модифицирование белков происходит, в основном, в ядре хрусталика, и концентрация связанного ЗОНКК увеличивается с возрастом: в хрусталиках ниже 50-летнего возраста не было обнаружено 3-гидроксикинуренина, присоединенного к кристаллинами, в то время как уже в 68-летнем хрусталике уровень связанного ЗОНКЫ составил 0.3 ммоль/моль белка [149]. Было показано, что при инкубировании белков бычьих хрусталиков в присутствии 3-гидроксикинуренина при pH 7.2 УФ-фильтры были связаны с цистеиновыми аминокислотными остатками кристаллинов. При увеличении pH до 9.5 кинуренины при инубироваиии присоединялись к лизиновым и гистидиновым аминокислотным остаткам. Объяснением может являться то, что при значении pH 9.5 происходит разворачивание белка, и такие аминокислотные остатки как лизиновый и гистидиновый становятся более доступными для реакции, причем гистидиновый - в большей степени. Ранее в работе Васкеза и др. [142] было показано, что в ядре нормального хрусталика к возрасту 80 лет концентрация кинуренина, присоединенного к гистидиновым остаткам кристаллинов, достигает 2.5 нмоль/мг белка, а к лизиновым - 0.12 нмоль/мг белка. Несмотря на то, что реакция нуклеофильного присоединения дезаминированных кинуренинов к цистеиновому остатку должна проходить с большей вероятностью [134], накопление модификаций идет, в основном, по лизинам и гистидинам в составе белков. Существует несколько факторов, влияющих на присоединение УФ-фильтров: во-первых, существенную роль играет стабильность образующихся связей кинуренин-белок при физиологических условиях; во-вторых, количество цистеиновых остатков в кристаллинах меньше (0.3 % - в а-кристаллинах, 1.7 % - в [3-кристаллинах, 3.3 % - в у-кристаллинах), чем суммарное количество гистидиновых и лизиновых (3-4 %) [134,142]. Было показано, что связь УФ-фильтров с цистеинами белков является нестабильной при физиологическом pH, и.в реакции разложения может высвобождаться ненасыщенный кетон, способный присоединяться уже к лизиновым и гистидиновым остаткам [142].
Известно, что уровень антиоксиданта ОБН существенно влияет на процессы окисления [150], и уменьшение концентрации глутатиона, в особенности в центральной части хрусталика, может играть важную роль в процессе окисления белков и развитии катаракты (Схема 1.3). Ковалентное присоединение УФ-фильтров к белкам хрусталика может изменять пространственную структуру белков, оказывая негативное влияние на их функционирование, и может являться причиной окрашивания кристаллинов, тем самым увеличивая их восприимчивость к облучению.