Исследование кинетики образования поверхностных комплексов антиген-антитело с помощью сканирующего проточного цитометра

• Автор: Суровцев, Иван Владимирович
• Шифр специальности: 01.04.17
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 110 с. : ил

Содержание
Введение
Глава!. Взаимодействие антиген-антитело: экспериментальные методы исследования и теоретические модели
§1.1. Взаимодействие антиген-антитело
1.1.1. «Антиген» и «антитело»
1.1.2. Физическая основа взаимодействия антиген-антитело
1.1.3. Характерные величины взаимодействия антиген-антитело
§ 1.2. Экспериментальные методы исследования взаимодействия антиген-антитело
§1.3. Математические модели взаимодействия антигеи-антитело
1.3.1. Равновесные модели
1.3.2. Кинетические модели связывания антигена с антителом
Глава 2. Экспериментальная установка и методика эксперимента
§2.1. Сканирующий проточный цитометр
§ 2.2. Измерение флуоресценции
2.2.1. «Перпендикулярная» конфигурация измерения флуоресценции
2.2.2. «Параллельная» конфигурация измерения флуоресценции
2.2.3. Сравнение перпендикулярной и параллельной конфигураций измерения флуоресценции
2.2.4. Процедуры, использованные при измерении флуоресценции
2.2.5. Постановка кинетического эксперимента и влияние красителя в растворе
§2.3. Использование светорассеяния для классификации частиц
Глава 3. Кинетические модели связывания лигандов с поверхностными рецепторами клетки и нммуноагглготинации
§3.1. Связывание моновалентного лиганда с моновалентным рецептором
3.1.1. Формулировка физической модели
3.1.2. Кинетическая схема процесса связывания

3.1.3. Приближение непрерывной функции распределения
3.1.4. Зависимость констант скоростей реакции от количества посадочных мест
3.1.5. Кинетический предел
3.1.6. Диффузионный предел
3.1.7. Распределение клеток по количеству занятых рецепторов
3.1.8. Необратимое связывание лиганда
3.1.9. Обсуждение результатов
§3.1. Кинетическая модель начальной стадии иммуноагглютинации
Глава 4. Экспериментальные кинетики образования комплексов антиген -антитело: иммунофлуоресценция и иммуноагглютинация
§4.1. Кинетика связывания флуоресцентно меченых антител с поверхностными рецепторами гибридомных клеток
4.1.1. Постановка экспериментов
4.1.2. Экспериментальные сигналы
4.1.3. Экспериментальные результаты и их обсуждение
§ 4.2. Исследование кинетики начальных стадий агглютинации
4.2.1. Возможность использования СПЦ для исследования ранних стадий
агглютинации
4.2.2 Экспериментальные кинетики образования димеров на начальной стадии агглютинации
Заключение
Приложение
А. 1. Решение уравнение для непрерывной функции распределения С(х,у) в кинетическом пределе
А.2. Решение уравнение для непрерывной функции распределения С(х,у) в диффузионном пределе
Литература

Введение
Защита организма от инфекции - бактериальной, вирусной, грибковой или паразитарной - осуществляется системой иммунитета. Любая макромолекула, чуждая организму, может вызвать иммунный ответ. Взаимодействие антиген-антитело играет ключевую роль в иммунитете, являясь основой распознавания “свой-чужой” на молекулярном и клеточном уровне.
Антитела в организме представлены как в растворенном виде, так и в качестве поверхностных рецепторов на мембранах иммунокомпетентных клеток [1]. В последнем случае реакция антиген-антитело является гетерогенной, как и в случае, когда антигеном служит чужеродный микроорганизм. Связывание антитела с антигеном осуществляется за счет большого числа нековалентных взаимодействий (вандерваальсовское, гидрофобное и т.д.) и является обратимой бимолекулярной реакцией. Для образования комплекса антиген-антитело характерны высокие константы равновесия (КГ -1011 М'1) и высокая специфичность взаимодействия [2]. Обычно считается, что разброс в константе скорости ассоциации для сходных по структуре антигенов невелик, а наблюдаемый разброс в константах равновесия вызван разницей в константах диссоциации комплекса антиген-антитело [ 3 ].Однако существуют экспериментальны данные, в которых наблюдалась обратная закономерность [4].
Взаимодействие антиген-антитело является элементарным актом иммунных процессов. Исследование реакции образования комплекса антиген-антитело необходимо для понимания молекулярной основы иммунитета. Изучение процесса образования комплекса антиген-антитело представляет интерес не только из-за явлений иммунитета. Антитела, особенно после распространения технологии моноклональных антител, являются одним из инструментов исследования в молекулярной биологии, С помощью антител идентифицировано большое количество клеточных рецепторов с различной функциональной ролью. Кроме того, возможно целенаправленное получение антител, имеющих структуру антиген-связывающего участка, сходную с молекулярной структурой других белковых молекул или вирусных рецепторов. Последнее особенно важно при исследовании взаимодействия особо опасных вирусов с клетками, поскольку антитела представляют в данном случае безопасную и адекватную модель вируса. Таким образом, исследование образования комплекса антиген-антитело выходит за рамки изучения только иммунной системы и оказывается связанным и с межклеточным взаимодействием, и с взаимодействием вирус-клетка. Во взаимодействии

§ 2.2. Измерение флуоресценции
2.2.1. «Перпендикулярная» конфигурация измерения флуоресценции
В данной работе светорассеяние от одиночных клеток использовалось для идентификации частиц. Информация о количестве антител, связавшихся с поверхностью клетки, определялась по сигналу флуоресценции. Для этого в принципиальную схему сканирующего проточного цитометра был добавлен еще один лазер для возбуждения флуоресценции в исследуемых частицах (лазерЗ на Рис.2.1). После выхода из зоны регистрации индикатрисы и пересечения триггерного луча клетки пересекают луч лазера 3 (Рис.2.1), возбуждающего флуоресценцию молекул красителя. Для возбуждения флуоресценции использовался непрерывный аргоновый лазер (488 нм, 5 мВт). Флуоресцентное излучение регистрировалось ФЭУ 2 под углами 90° к возбуждающему лучу аргонового лазера и к лучу индикатрнсного лазера. Для уменьшения паразитной засветки использовалась оптическая система, состоящая из объектива 3, линзы 3, и диафрагмы 3 (Рис.2.1).
Для записи экспериментальных данных использовалась посттриггерная система запуска. Сигнал светорассеяния (сумма сигналов с индикатрнсного и триггерного фотоприемников) и сигнал флуоресценции подаются на входы двух разных каналов аналого-цифрового преобразователя (АЦП). АЦП непрерывно оцифровывает экспериментальный сигнал светорассеяния. При обнаружении триггерного импульса из памяти считывается определенное количество предшествующих (соответствующие индикатрисному сигналу светорассеяния) и последующих точек (это необходимо для измерения флуоресценции) с обоих каналов АЦП. Полученные данные записываются в память компьютера в виде непрерывной последовательности значений сигнала на входе АЦП, и система снова переходит в режим ожидания триггерного сигнала.
Таким образом, измеренный сигнал от каждой клетки состоит из сигнала индикатрисы светорассеяния, триггерного сигнала и сигнала флуоресценции. Рис.2.3, на котором приведены сигналы от двух полистирольных латексных частиц (а -флуоресцирующая, размер 1.8 мкм, Ь - нефлуоресцирующая, размер 3.1 мкм), дает представление о характерных экспериментальных сигналах. На рисунке указаны три составные части экспериментального сигнала - индикатриса светорассеяния, триггер и флуоресценция. Для удобства сигнал с флуоресцентного канала для тех же частиц показан в большем масштабе. Результатом измерения каждой пробы является распределение по флуоресценции в виде гистограммы. На Рис. 2.4 приведены данные для флуоресцентных латексных частиц, использованных нами для калибровки