Аллельный полиморфизм и альтернативный сплайсинг в формировании полиморфности цитокиновой сети

• Автор: Силков, Александр Николаевич
• Шифр специальности: 14.03.09
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 212 с. : 12 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Цитокиновая сеть - сложная система регуляторных белков
1.2. Генетический полиморфизм белков цитокиновой сети
1.2.1. Функциональная значимость аллельного полиморфизма цитокинов
1.2.2. Аллельные варианты генов цитокинов в качестве биологических макеров предрасположенности и прогноза
1.2.3. Аллельные варианты цитокинов как составной копонент персонифицированной медицины
1.3. Альтернативный сплайсинг - молекулярный механизм формирования
полиморфности цитокиновой сети
1.3.1. Распространенность альтернативного сплайсинга
1.3.2. Варианты образования сплайс-форм транскриптов цитокинов и их рецепторов
1.3.3. Регуляторный потенциал сплайс-вариантов цитокинов и рецепторов
1.3.4. Характеристики сплайс-вариантов некоторых цитокинов
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Выделение и культивирование мононуклеарных клеток периферической крови
человека
2.2. Определение уровня продукции цитокинов МНК ПК in vitro на
электрохемилюминометре
2.3. Иммуноферментный анализ концентрации цитокинов
2.4. Выделение ДНК
2.5. Выделение суммарной клеточной РНК
2.6. Реакция обратной транскрипции (ОТ)
2.7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
2.8. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК
2.9. Элюция из фрагментов ДНК из ПААГ
2.10. Секвенирование и анализ последовательностей
2.11. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции
2.12. Генотипирование ИЛ-lß по полиморфизмам +3954С/Т и -31С/Т методом ПЦР с
последующей рестрикцией продукта амплификации
2.13. Генотипирование IL2 по полиморфизмам -675G/A, -475 А/T и +114G/T методом
ПЦР с последующей рестрикцией продукта амплификации
2.14. Генотипирование ИЛ-18 по полиморфизмам -607С/А и -137 G/С методом аллель
специфической ПЦР
2.15. Генотипирование промоторного региона гена TNF
2.16. Статистический анализ результатов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Результаты исследования продукции цитокинов у носителей разных аллельных вариантов генов в норме
3.1.1. Изучение продукции IL-lß в культуре МНК у носителей разных аллельных
вариантов гена IL1B в норме
3.2. Исследование частот аллелей и генотипов генов цитокинов при патологии
3.2.1. Частоты аллелей и генотипов полиморфных вариантов +3954С>Т и -31С>Т гена
IL1B у больных РМЖ и в популяционной выборке женщин г. Новосибирска
3.2.2. Частоты аллелей и генотипов полиморфизмов-675G>A, -475 А>Т и+114G>T гена
IL2 у больных РМЖ и в популяционной выборке женщин г. Новосибирска
3.2.3. Частоты аллелей и генотипов полиморфизмов -607С>А и -137G>C гена IL18 у
больных РМЖ и в популяционной выборке женщин г. Новосибирска
3.2.4. Анализ распределения полиморфных вариантов гена IL1B у условно здоровых
доноров и больных РА
3.2.5. Анализ распределения полиморфных вариантов гена TNF среди здоровых
доноров и больных РА
3.3. Изучение частоты встречаемости полиморфных вариантов генов провоспалительных цитокинов TNF-a, IL-lß в группах больных ревматоидным артритом, с разной эффективностью терапии инфликсимабом
3.3.1. Изучение ассоциации полиморфных вариантов гена TNF-a с эффективностью
терапии инфликсимабом у больных РА
3.3.2. Изучение ассоциации полиморфных вариантов гена IL1B с эффективностью
терапии инфликсимабом у больных РА
3.4. Результаты исследования тканеспецифичности и онтогенетических особенностей экспрессии сплайс-вариантов МРНК цитокинов

3.4.1. Альтернативный сплайсинг мРНК IL-4 у человека
3.4.2. Альтернативный сплайсинг мРНК гена IL-6 у человека
3.4.3. Сплайс-варианты мРНК лейкемия-ингибирующего фактора (LIF) в различных фетальных тканях человека
3.4.4. Сплайс-варианты мРНК фактора стволовых клеток (SCF) в различных фетальных тканях человека
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1. Исследование продукции цитокинов у носителей разных аллельных вариантов генов в норме
4.2. Ассоциация полиморфных вариантов генов цитокинов с предрасположенностью к развитию рака молочной железы
4.3. Аллельный полиморфизм генов цитокинов при ревматоидном артрите
4.4. Изучение ассоциации полиморфных вариантов гена TNF-a с эффективностью терапии инфликсимабом у больных РА
4.5. Исследование экспрессии сплайс-вариантов мРНК генов цитокинов у человека
4.5.1. Альтернативный сплайсинг IL-4 и IL-6 у человека
4.5.2. Альтернативный сплайсинг факторов роста LIF и SCF у человека
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

использованию альтернативных промоторов и регуляторных цис-элементов ДНК [76, 101].
Второй тип показан для пре-мРНК, имеющих 3’проксимальные последовательности разной длины в результате использования альтернативных сайтов полиаденилирования [23]. Таким способом происходит образование секреторной и мембраносвязанной форм 1Ь-5Яа [23, 266].
Третий тип альтернативного сплайсинга наиболее разнообразный и сложный. При этом из абсолютно идентичных пре-мРНК формируются разные по структуре функциональные мРНК. В пре-мРНК присутствуют все потенциальные экзоны, и при сплайсинге происходит выбор между ними [23, 117]. Так 1Ь-452 является производной, альтернативно сплайсированной формой мРНК 1Ь-4, в которой удален экзон 2 [37, 165, 257]. Также образуются альтернативные варианты 1Ь-6 [64, 161] и 1Ь-2 [273].
В некоторых случаях в сплайсинге третьего типа могут принимать участие криптические сайты сплайсинга, расположенные внутри экзона или интрона, что приводит к укорочению экзона или его удлинению, за счет интронной последовательности. Такой вариант событий приводит к синтезу функционального белка только при сохранении соответствующей рамки считывания и свойственен, как правило, вирусам. Однако недавно было показано наличие и использование криптических сайтов сплайсинга такими цитокинами как: мышиный 1Ь-15 (интрон 5) [228] и ТОБ-Р (дополнительный экзон внутри интрона 5) [291]. Механизм выбора сайтов сплайсинга мРНК, вероятно, неоднозначен. Имеется два основных предположения: (1) Выбор сайтов зависит от структурных элементов самой пре-мРНК и промежуточных продуктов сплайсинга т.н. цис-факторов; (2) Основную роль играют