Создание бактериального продуцента рекомбинантного человеческого Г-КСФ на базе технологии слитных белков

• Автор: Скрыпник, Ксения Александровна
• Шифр специальности: 14.01.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 100 с. : ил.

Содержание

Список сокращений

Введение

Обзор литературы

Г-КСФ, молекулярная организация

Рецептор чГ-КСФ

Запуск сигнальных каскадов

Клиническое применение

Перспективы применения чГ-КСФ

Пути получения рекомбинантных белков

Рекомбинантные аналоги Г-КСФ
Экспрессия чужеродных генов в бактериях
Материалы и методы
Материалы
Бактериальные штаммы и плазмиды
Состав сред и условия культивирования
Система экспрессии и очистки белков IMPACT
Стандарты молекулярной массы белков и размеров
фрагментов ДНК
Клеточные линии
Стандарт чГ-КСФ
Методы
Выделение плазмидной ДНК
Приготовление компетентных клеток E.coli и их
трансформация
Сайт-специфический мутагенез методом полимеразной цепной реакции
Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК

3.2.5. Генно-инженерные манипуляции с ДНК
3.2.6. Выделение фрагментов из агарозного геля
3.2.7. Скрининг клонов
3.2.8. Индукция экспрессии Г-КСФ
3.2.9. Приготовление лизатов клеток
3.2.10. Электрофоретическое разделение белков в ПААГ
3.2.11. Вестерн-блоттинг
3.2.12. Иммуноферментный анализ
3.2.13. Концентрирование проб, содержащих белок
3.2.14. Очистка белка
3.2.15. Проверка биологической активности чГ-КСФ с использованием клеток НЛ
Результаты
Сайт - специфический мутагенез гена чГ-КСФ с использованием ПЦР
Вставка фрагмента чГ-КСФ в вектор рТУВ11, отбор и проверка клонов
Индукция экспрессии конструкции рТУВ11-ОС15 в присутствии ИПТГ
Определение концентрации чГ-КСФ в составе гибридного белка
Связывание гибридного белка с хитиновым сорбентом. Индукция автопротеолитической активности в гибридном белке
Введение замен в последовательность чГ -КСФ с целью индукции автопротеолитической активности интеина в составе гибридного белка. Индукция экспрессии гибридного белка
Очистка чГ-КСФ с помощью аффинной хроматографии
4.8. Проверка биологической активности т У17го
5. Обсуждение
Выводы
6. Список литературы

или трансфецирование спермы (Cappello F et al., 2000, Lazzereschi D. et al.2000).
Недостатками этого пути являются сложность, длительность и низкая эффективность получения трансгенных животных.
К преимуществам использования животных-биореакторов можно отнести следующие: животное легко воспроизводимо' естественным путем, передает своему потомству способность воспроизводить целевой продукт. Целевой белок подвергается посттрансляционным модификациям, чего не происходит при использовании ' микроорганизмов. Использование трансгенных животных позволяет получать достаточно большие количества целевого белка (до 1г на литр), соответственно, единицы, или десятки трансгенных животных способны обеспечить мировой фармацевтический рынок необходимым белком.
Выбор животного определяется его продуктивностью, сроками получения целевого белка, необходимым количеством.нужного препарата.
Наиболее часто используемым путем экспрессии является экспрессия целевого белка в молоко трансгенных животных. Впервые этот таким образом. из’ молока трансгенных мышей был получен козий (3-лактоглобулин. (Simons et al., 1987). В настоящее время получен ряд терапевтических белков, которые были экспрессированы, при использовании, тканеспецифичных промоторов молочной железы — проведены работы и»по получению чГ-КСФ в этих экспрессионных системах.
Конструкция, несущая ген чГ-КСФ под контролем козьего бета-казеинового промотора, была введена в, зиготы с помощью микроинъекции.(Ко JH et al., 2000). Уровень экспрессии в козьем молоке во время лактации составил 50 мкг/мл.
Полученный целевой белок обладал биологической активностью, что было показано в опытах in vitro и in vivo.
Проведены исследования экспрессии чГ-КСФ в молоко трансгенных кроликов. В. зиготы вводилась конструкция, несущая чГ-КСФ под контролем