Роль клеток реципиента и нарушения структуры тканевого матрикса в механизме кальцификации трансплантатов сосудов и клапанов сердца

• Автор: Фадеева, Ирина Сергеевна
• Шифр специальности: 03.03.01
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 158 с. : ил.

~ 2 ~
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Морфология, анатомия и гистология клапанов сердца
1.1.1 Анатомическое строение клапанов сердца
1.1.1.1 Строение аортального клапана
1.1.1.2 Строение митрального клапана
1.1.1.3 Строение клапана легочной артерии
1.1.1.4 Строение трикуспидального клапана
1.1.2 Архитектоника внеклеточного матрикса клапанов сердца
1.1.2.1 Состав внеклеточного матрикса клапанов сердца
1.1.2.1.1 Эластин и белки микрофибрилл эластических волокон
1.1.2.1.2 Сосудистый коллаген и лизилоксидазы
1.1.2.1.3 Протеогликаны
1.2 Тканевая инженерия трансплантатов клапанов сердца и сосудов
1.2.1 Становление тканевой инженерии трансплантатов клапанов сердца и сосудов
1.2.2 Основные направления тканевой инженерии трансплантатов клапанов сердца и сосудов
1.2.2.1 Тканевая инженерия клапанов сердца и сосудов на основе
девитализированных и децеллуларизированных биологических матриц
1.2.2.2 Техники репопуляции трансплантатов клапанов сердца и сосудов
1.3 Общие представления о кальцификации биологических тканей
1.3.1 Кальциноз собственных сосудов человека, минерализация биопротезов и их связь с и минерализацией трансплантатов сосудов и клапанов сердца
1.3.1.1 Митохондриальная гипотеза кальцификации трансплантатов клапанов сердца и сосудов
1.3.1.2 Липидная гипотеза кальцификации биопротезов клапанов сердца и сосудов
1.3.1.3 Клеточная гипотеза кальцификации клапанов сердца и сосудов
1.3.2 Ингибиторы и активаторы гетеротопической кальцификации сосудистой ткани
1.3.3 Эластокальциноз
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Материалы
2.1.1 Флуоресцентный экспресс-метод оценки жизнеспособности, митотической активности и формы клеточной гибели in vitro и ex vivo
2.2 Обработка материала
2.2.1 Девитализация/децеллуларизация ткани
2.3 Культура клеток
2.3.1 Использование постоянной клеточной линии
2.3.2 Получение первичной культуры гладкомышечных клеток
2.4 Изучение биосовместимости девитализированных/децеллуларизированных тканей in vitro
2.5 Модель подкожной имплантации биоматериалов крысам
2.5.1 Техника подкожной имплантации биоматриалов крысам
2.5.2 Лабораторные животные
~ 3 ~
2.6 Проведение гистологического и гистохимического анализа
2.6.1 Получение криосрезов
2.6.2 Гистологический анализ
2.6.3 Гистохимический анализ
2.6.4 Флуоресцентная микроскопия
2.8 Количественное определение минерализованного кальция
2.9 Статистический анализ
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Влияние разрушения клеток донора на степень дегенерации и кальцификации трансплантатов сосудов и клапанов сердца
3.2 Изучение роли клеток реципиента в кальцификации трансплантатов сосудов и клапанов сердца
3.3 Выяснение роли липидов в кальцификации трансплантатов сосудов
и клапанов сердца
3.4 Роль повреждений внеклеточного матрикса в кальцификации трансплантатов сосудов и клапанов сердца
3.5 Разработка способа предотвращения кальциноза и повышения биосовместимости трансплантатов сосудов и клапанов сердца на основе полученных результатов
3.6 Разработка способа ускорения репопуляции трансплантатов сосудов
и клапанов сердца
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ФИНАНСОВАЯ ПОДДЕРЖКА РАБОТЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ
Поражение клапанов сердца в виде их стеноза, недостаточности и смешанных (комбинированных) форм встречаются очень часто и составляют около 25% всех заболеваний сердца. По своей распространенности они уступают лишь ишемической, гипертонической болезням сердца и окклюзионным поражениям сосудов [108, 205, 219]. При этом численность больных с поражением сосудистых и клапанных структур увеличивается не только в ситуации демографического старения, но и среди молодого населения [66, 219]. Вместе с тем сердечно-сосудистая хирургия и тканевая инженерия являются одними из самых быстро и успешно прогрессирующих областей науки, и своевременно выполненные операции по замене патологически измененных сосудов или клапанов сердца не только предотвращают инвалидизацию многих тысяч больных, но и реально снижают уровень смертности [62, 108, 153,255].
Помимо врожденных н приобретенных изменений сосудов и клапанов сердца дегенеративного генеза, частым показанием для замены является кальциноз клапанов сердца и сосудов эластического типа. При этом такой тип патологической минерализации сосудистых тканей является терминальной стадией их патологических изменений и не поддается медикаментозной коррекции [1, 224]. Единственным способом лечения в данном случае также является хирургическая замена поврежденных структур соответствующим протезом или трансплантатом [10, 11,23, 149, 153,219].
Разработка и применение биологических заменителей клапанов сердца в значительной степени связано с недостатками механических клапанов, такими как тромбоэмболические осложнения, необходимость пожизненного приема антикоагулянтов, шумовой эффект, протезный эндокардит и т.д., а также недостатками фиксированных кросс-сшивающими агентами и эпоксисоединениями биопротезов, такими как неспособность к росту, поддержанию и обновлению структуры ткани, токсическое действие консервирующих агентов, развитие синдрома «несоответствие протез-пациент» и т.д. [13, 62, 108, 153, 154].
Альтернативой имеющимся протезам является применение модифицированных нефиксированных алло- и ксенотрансплантатов. Данные трансплантаты не требуют приема антикоагулянтов, иммунодепрессантов и потенциально способны к полному «вживлению» и, следовательно, росту в организме реципиента, что является крайне актуальной задачей детской кардиохирургии врожденных и приобретенных клапанных пороков сердца [109]. Однако, несмотря на имеющиеся преимущества, применение данных трансплантатов ограничено развивающейся после имплантации патологической кальцификацией их тканевого матрикса,
переносчиков заболеваний должны быть удалены или определенным образом лишены антигенов [89].
Известно, что аллогенные ткани не обладают иммуногенностыо: иммунная реакция развивается исключительно на антигены, ассоциированные с клеточной поверхностью клеток донора [22]. Потенциал иммуногенной реакции при имплантации ксеногенного внеклеточного матрикса был достаточно хорошо изучен [89]. Показано, что у части пациентов (от 1 до 8%) развивалась иммунная реакция на очищенный коллагеновый матрикс быка [146], в отличие от такового свиньи, показавшего отсутствие каких-либо побочных реакций и высокую биосовместимость [170]. Необходимо отметить, что перенос зоонозов (PERV, эндогенного ретровируса и BSE, губчатой энцефалопатии) также возможен только в случае применения ксенотканей. При применении аллотрансплантатов используются только технологии стандартной стерилизации ткани [89].
Также в качестве девитализированных или децеллуларизированных биологических матриц для тканевой инженерии клапанов сердца и сосудов широко используют перикард сердца и подслизистый слой тонкого кишечника {small-intestinal submucosa (SIS)). Последние изготавливают путем удаления серозного слоя, выворачиванием и удалением слизистой поверхности. Указанные матрицы представляют собой бесклеточные структуры с наименьшей межвидовой иммуногенностыо, показавшие к тому же при орготопической имплантации высокий регенеративный потенциал [27, 37, 70]. К сожалению, основное препятствие в том, что воссоздание сложной трехмерной геометрии створчатых клапанов из плоских листков нефиксированных тканей перикарда или SIS пока является технически сложным [23, 27].
Для девчшалчзацчч более перспективных в клиническом применении донорских клапанов сердца используют агенты, вызывающие некротическую или апоптотическую гибель клеток донора в тканевом матриксе, которые можно легко отмыть из матрикса для предотвращения их токсического эффекта [2].
Для децеллуларчзацич матрикса трансплантатов, как правило, используют протеолитические ферменты, хелатирующие агенты, сольвенты и детергенты. Важным моментом при проведении предимплантационной обработки является использование ингибиторов протеаз, активация которых при литической гибели клеток может привести к аутолизу белков ВКМ [43, 94, 95,124, 160,205].
В научной литературе описаны следующие способы удаления или разрушения клеточных элементов: использование химических агентов (кислоты, основания); осмотический (гипо и гипертонический) шок; замораживание/размораживание; энзиматические обработки (трипсин, нуклеазы, диспаза); обработка детергентами - додецилсульфато.м натрия (SDS), дезоксихолатом натрия (DOA), Triton Х-100, MEGA 10, CHAPS, SB-10, SB-16, Tween 20; обработка сольвентами