Морфофункциональная характеристика мезенхимальных стромальных клеток из жировой ткани человека, культивируемых при пониженном содержании кислорода

• Автор: Рылова, Юлия Владимировна
• Шифр специальности: 03.03.01, 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 167 с. : ил.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
Цели и задачи исследования
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Характеристика мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток
1.1.1 Локализация ММСК
1.1.2 Иммунофенотип культивируемых ММСК
1.1.3 Морфология культивируемых ММСК
1.1.4 Колониеобразование и пролиферативная активность ММСК
1.1.5 Дифференцировочный потенциал ММСК
1.1.6 Механизмы, регулирующие пролиферацию и диффернцировку ММСК
1.2 Влияние пониженного содержания кислорода на свойства ММСК
1.2.1 Иммунофенотип и морфология ММСК
в условиях пониженного содержания кислорода
1.2.2 Влияние пониженного содержания кислорода
на колониеобразование и пролиферативный потенциал ММСК
1.2.3 Дифференцировочный потенциал ММСК
в условиях пониженного содержания кислорода
1.2.4 Механизмы поддержания жизнеспособности ММСК
в условиях пониженного содержания кислорода
1.3 Метаболизм глюкозы и биоэнергетическая функция
митохондрий ММСК в условиях пониженного содержания кислорода
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Используемое оборудование, материалы и реактивы
2.1.1 Оборудование
2.1.2 Химические реагенты
2.1.3 Антитела
2.2 Приготовление сред для культивирования ММСК
2.2.1 Приготовление ростовой среды
2.2.2 Приготовление остеогенной среды
2.2.3 Приготовление адипогенной среды
2.2.4 Приготовление среды для криоконсервации клеток

2.3 Получение и культивирование ММСК жировой ткани человека
2.3.1 Получение первичных культур ММСК
2.3.2 Культивирование ММСК
2.3.3 Экспансия ММСК в условиях пониженного содержания кислорода
2.3.4 Криоконсервация культивируемых ММСК
2.4 Индукция дифференцировки ММСК жировой ткани in vitro
2.4.1 Индукция остеогенной дифференцировки
2.4.2 Индукция адипогенной дифференцировки
2.5 Оценка характеристик ММСК жировой ткани
2.5.1 Метод проточной цитофлуориметрии
2.5.2 Иммуноцитохимическое окрашивание для выявления
поверхностных маркеров
2.5.3 Исследование морфологии культивируемых ММСК
2.5.4 Оценка колониеобразующей способности
2.5.5 Анализ пролиферативной активности
2.5.6 Выявление (3-галактозидазы в культивируемых ММСК
2.5.7 Количественная оценка апоптотических и некротических клеток
2.5.8 Определение стадии клеточного цикла культивируемых ММСК
2.5.9 Оценка дифференцировочного потенциала ММСК
2.5.9.1 Оценка дифференцировки ММСК в остеогенном направлении
2.5.9.2 Оценка дифференцировки ММСК в адипогенном направлении
2.5.10 Определение количественного содержания глюкозы
и лактата в среде культивирования
2.5.11 Выявление митохондрий и характеристика
их трансмембранного потенциала
2.6 Определение уровня экспрессии генов
2.6.1 Определение уровня экспрессии гена теломеразы
2.6.2 Определение уровня дифференциальной экспрессии генов ММСК
2.7 Статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Морфология ММСК жировой ткани
3.1.1 Морфологическая гетерогенность культуры ММСК
3.1.2 Влияние различного содержания кислорода на морфологию ММСК
3.1.3 Экспрессия генов ММСК, ассоциированных с морфологией
3.2 Пролиферативный потенциал ММСК жировой ткани
3.2.1 Характеристика пролиферативной активности культивируемых ММСК
3.2.2 Влияние пониженного содержания кислорода
на пролиферативную активность
3.2.3 Клоногенный потенциал ММСК
в условиях различного содержания кислорода
3.2.4 Экспрессия генов, ассоциированных с пролиферацией ММСК
3.2.4.1 Уровень экспрессии гена теломеразы
в условиях различного содержания кислорода
3.2.4.2 Уровень дифференциальной экспрессии генов ММСК,
опосредующих пролиферацию
3.3 Иммунофенотип ММСК жировой ткани
3.3.1 Характеристика иммунофенотипа культивируемых ММСК
3.3.2 Влияние пониженного содержания кислорода на иммунофенотип ММСК
3.4 Дифференцировочный потенциал ММСК жировой ткани
3.4.1 Остеогенный и адипогенный дифференцировочный потенциал
3.4.2 Остеогенный и адипогенный дифференцировочный потенциал
в условиях пониженного содержания кислорода
3.5 Метаболизм глюкозы ММСК при различном содержании кислорода
3.5.1 Потребление глюкозы и продукция лактата
при различном содержании кислорода
3.5.2 Влияние различного содержания кислорода на
функциональное состояние митохондрий ММСК
3.5.3 Экспрессия генов ММСК, ассоциированных с метаболизмом глюкозы
3.6 Жизнеспособность ММСК жировой ткани
3.6.1 Влияние различного содержания кислорода на жизнеспособность
3.6.2 Экспрессия генов ММСК, ассоциированных с жизнеспособностью
3.7 Обратимость эффектов пониженного содержания кислорода
на функциональные характеристики ММСК жировой ткани

уровень продукции лактата жтММСК, культивируемыми в условиях атмосферного содержания кислорода, исследователи предположили, что это вызвано нарушениями метаболизма в результате активной клеточной пролиферации или увеличением потребления кислорода клетками. Возможно, активная пролиферация клеток, вероятно, могла создавать участки локальной гипоксии, в результате чего происходил сдвиг метаболизма в сторону анаэробного гликолиза (Follmar, Decroos, Prichard et al., 2006).
Однако чуть более поздние исследования показали, что экспозиция кмММСК в условиях 0,5% содержания кислорода в течение 72 часов не оказывала повреждающего воздействия на клетки, более 95% клеток сохраняло высокий уровень жизнеспособности. Добавление ингибитора дыхательной цепи 2,4-динитрофенола к кмММСК в условиях 20% содержания кислорода тоже не сопровождалось гибелью клеток, и не изменяло трансмембранный потенциал митохондрий. Это позволило предположить, что кмММСК используют преимущественно гликолитический путь получения энергии. Интересно отметить, что экспансия клеток в условиях гипоксии в течение 48 часов, тем не менее, приводила к постепенному снижению продукции АТФ более чем в два раза, по сравнению с контрольными условиями (20% О2). Отсутствие сыворотки и добавление ингибитора гексокиназы 2-дезоксипиокозы (гликолиз) в течение 72 часов приводило к постепенному увеличению доли поврежденных клеток и активности каспазы 3. При этом уже через 12 часов экспозиции детектировался очень низкий уровень продукции АТФ (6% от значений в условиях стандартного культивирования). Депривация глюкозы, также приводила к резкому уменьшению продукции АТФ до 20%, которая в процессе дальнейшей экспозиции не менялась, подтверждая, что в стандартных условиях культивирования не менее 80% общего количества АТФ в клетке синтезируется гликолитическим путем (Mylotte, Duffy, Murphy et al., 2008).
Опираясь на исследования уровня содержания кислорода в различных тканях, которая варьирует в пределах 1% — 7% в зависимости от степени кровоснабжения ткани, другая группа исследователей, провела сравнительный анализ влияния различной степени гипоксии на ММСК пуповины. Представленные результаты свидетельствуют, что в ряду уменьшения концентрации кислорода в среде культивирования 20%—»5%—>2,5%—>-1,5% за 72 часа экспозиции происходило снижение количества потребляемого кислорода. При этом клетки во всех условиях активно пролиферировали и сохраняли жизнеспособность. Как и клетки-предшественники костного мозга, ММСК пуповины, культивируемые в течение 72 часов при 1,5% О2 потребляли значительно больше глюкозы и продуцировали больше лактата, по сравнению со стандартными условиями. При 2,5% СЬ в среде культивирования количество продуцируемого лактата и потребляемой глюкозы было