Разработка тест-систем для идентификации вируса миксомы кроликов на основе анализа генома

• Автор: Моргунов, Сергей Юрьевич
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Покров
• Количество страниц: 128 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
1 ВВЕДЕНИЕ
1.1 Актуальность темы
1.2 Степень разработанности проблемы
1.3 Цели и задачи исследования
1.4 Научная новизна работы
1.5 Практическая и теоретическая значимость работы
1.6 Соответствие содержания диссертации паспорту специальности, по которой она рекомендуется к защите
1.7 Апробация работы
1.8 Публикация научных исследований
1.9 Основные положения диссертации выносимые на защиту
1.10 Структура и объем диссертационной работы
1.11 Личный вклад соискателя
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 Историческая справка
2.2 Распространение и эпизоотологические особенности миксоматоза кроликов
2.2.1 Источники и пути передачи инфекции
2.2.2 Молекулярные механизмы эволюции вируса миксомы
2.2.3 Патогенез и клинические признаки миксоматоза кроликов
2.3 Общая характеристика возбудителя миксоматоза кроликов
2.3.1 Молекулярная биология вируса миксомы
2.3.2 Антигенная структура, вариабельность и родство
2.3.3 Генетическое родство
2.3.4 Культивирование вируса миксомы кроликов
2.3.5 Устойчивость возбудителя
2.4 Диагностика миксоматоза кроликов

2.4.1 Гистологические исследования
2.4.2 Серологические исследования
2.4.3 Биопроба
2.4.4 Диагностика миксоматоза кроликов на основе методов анализа генома
2.4.5 Профилактика и меры борьбы
2.5 Заключение по обзору литературы
3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1 Материалы
3.1.1 Вирусы
3.1.2 Культуры клеток
3.1.3 Образцы патологических материалов
3.1.4 Животные
3.1.5 Соли, реагенты для приготовления растворов, буферных смесей
3.1.6 Растворы и реактивы
3.1.7 Бактериальный штамм и плазмида
3.2 Методы
3.2.1 Отбор и подготовка биологических материалов для исследований
3.2.2 Выделение нуклеиновых кислот
3.2.3 Постановка полимеразной цепной реакции
3.2.4 Электрофоретическая детекция продуктов ПЦР
3.2.5 Выделение и очистка продуктов ПЦР
3.2.6 Нуклеотидное секвенирование
3.2.7 Клонирование фрагментов генов
3.2.8 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
3.2.9 Статистическая обработка результатов исследований
4 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
4.1 Разработка тест-системы для выявления ДНК вируса миксомы методом ПЦР

4.1.1 Подбор праймеров и оптимизация режима амплификации
4.1.2 Проверка специфичности тест-системы
4.1.3 Определение чувствительности тест-системы
4.2 Разработка тест-системы для выявления геномов вируса миксомы и вируса фибромы Шоупа методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
4.2.1 Расчет праймеров для выявления геномов вируса миксомы и вируса фибромы Шоупа методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
4.2.2 Оптимизация условий проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального ремени
4.2.3 Конструирование положительного контроля к тест-системе для выявления ДНК вируса миксомы методом полимеразной цепной реакции
в режиме реального времени
4.3 Разработка тест-системы для выявления геномов вирусов миксомы кроликов и ГБК методом мультиплексной ПНР в режиме реального времени
4.3.1 Определение аналитической чувствительности набора препаратов для одновременного выявления геномов вирусов ГБК и миксомы кроликов
4.3.2 Определение аналитической чувствительности, выраженной в количестве копий нуклеиновых кислот
4.4 Определение филогенетических связей вакцинных штаммов и изолятов, выделенных при вспышках миксоматоза в Российской Федерации
5 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ
6 ВЫВОДЫ
7 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
8 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
9 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
10 ПРИЛОЖЕНИЯ

области наружных половых органов и заднепроходного отверстия. К концу болезни кролики сильно худеют и погибают через 8- 10 дней.
Диагноз ставится на основании эпизоотологических, клинических, паталогоанатомических и лабораторных исследований [Гуненков В.В.и др., 1983,1987].
2.4.4 Диагностика миксоматоза кроликов на основе методов анализа
генома
В современной лабораторной диагностике инфекционных болезней в целом, существуют два основных подхода:
- непосредственное выявление возбудителя заболевания или его компонентов (генома, антигенов) в органах и тканях больных животных;
-выявление антител к возбудителю в крови животных. Эти два подхода дополняют друг друга и являются основой ранней и ретроспективной диагностики, что особенно важно для серонегативных животных.
Сероконверсия может занять долгое время, и некоторые инфицированные животные могут быть не в состоянии развить поддающийся обнаружению гуморальный иммунный ответ [Щербаков A.B., 2008].
Последние три десятилетия во всем мире развернуты исследования по созданию диагностических средств и методов на основе анализа структуры нуклеиновых кислот, определяющих индивидуальность любого организма.
Эти методы, хотя и являются относительно трудоемкими и требуют высокой квалификации исследователя, являются наиболее информативными и позволяют обнаруживать геном возбудителя с высокой точностью и чувствительностью, независимо от антигенной и фенотипической изменчивости [Angulo, E. et al, 2007, Barcena, J. et al, 2009, Best, S. M. et al, 2000].
Высокая специфичность метода ПЦР, обусловленная тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для