Модулирующий эффект экзогенного белка теплового шока (БТШ70) на клетки врождённого иммунитета млекопитающих при действии липополисахаридов разной структуры

• Автор: Антонова, Ольга Юрьевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 121 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1. Клетки врожденного иммунитета
1.2. Липополисахариды
1.2.1. Строение молекулы ЛПС. Хемотипы ЛГТС
1.2.2. Физико-химические свойства молекулы ЛПС
1.2.3. Механизм взаимодействия ЛПС с клеткой
1.3. Липотейхоевая кислота
1.4. Белки теплового шока
1.4.1. Строение молекулы БТШ70
1.4.2. Внутриклеточные функции БТШ70
1.4.2.1. Антиапоптотическая роль БТШ70
1.4.2.2. Противовоспалительные функции БТШ70
1.4.3. Внеклеточный БТШ70
1.4.3.1. Механизмы выхода БТШ70 из клетки
1.4.3.2. Взаимодействие внеклеточного БТШ70 с клетками врожденного иммунитета
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объекты исследования
2.2. Методы исследования
2.2.1. Исследование продукции АФК с использованием люминол-зависимой хемилюминесценции (ХЛ)
2.2.2. Определение секреции Т1ЧБ-а
2.2.3. Исследование кинетики процесса взаимодействия экзогенного БТШ70 с клетками
2.2.4. Определение изменения количества ТЫ1-2 и ТЬН-4 на клеточной мембране методом флуоресцентной микроскопии

2.2.5. Определение изменения количества CD1 lb на клеточной мембране
методом проточной цитометрии
2.2.6. Определение клеточной локализации экзогенного БТШ70
2.2.7. Исследование экспрессии TLR-4 и TLR-2 рецепторов с использованием количественной ПЦР в реальном времени
2.2.8. Исследование внутриклеточных сигнальных путей с участием PI3K, PLC, ERK, р38, JNK and NF-кВ при действии экзогенного БТШ70 и ЛИС
2.2.9. Использованные реактивы
2.2.10. Статистическая обработка данных
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
3.1. Определение оптимальных условий для исследования защитного
эффекта экзогенного БТШ70 на продукцию АФК макрофагами RAW
3.1.1. Исследование влияния времени инкубации и различных концентраций ЛПС на продукцию АФК клетками RAW
3.2. Исследование влияния экзогенного БТШ70 на функциональную активность нейтрофилов, моноцитов и макрофагов при действии разных хемотипов ЛПС E
3.2.1. Влияние БТШ70 на продукцию АФК фагоцитами при действии ЛТК и различных хемотипов ЛПС
3.2.2. Влияние БТШ70 на продукцию TNF-a фагоцитами при действии ЛТК и различных хемотипов ЛПС
3.2.3. Действие БТШ70 на ЛПС и ЛТК - индуцированный апоптоз нейтрофилов
3.3. Исследование влияния экзогенного БТШ70 на рецепторы CD1 lb нейтрофилов и TLR-4 моноцитов при действии разных хемотипов ЛПС Е
3.4. Исследование взаимодействие экзогенного БТШ70 с фагоцитами

3.4.1. Исследование кинетики процесса взаимодействия экзогенного рекомбинантного БТШ70 с клетками и определения клеточной локализации
3.4.2. Влияние ингибитора ТЬЯ-4 сигнализации СІЛ-095 на секрецию Т№-а нейтрофилами и моноцитами
3.4.3. Влияние экзогенного БТШ70 на изменение количества ТІЛІ-2 и ТЫЗ-4 фагоцитами крови
3.4.4. Влияние ингибитора№-кВ Вау 11-7082 на изменение количества ТБ 11-4 рецептора моноцитами
3.4.5. Влияние экзогенного БТШ70 и теплового шока на экспрессию рецепторов Т1Л-2 и ТЫМ макрофагами
3.5. Изучение внутриклеточных сигнальных путей, задействованных экзогенным белком БТШ70, в защите фагоцитов при действии ЛПС
3.5.1. Исследование участия внутриклеточных сигнальных молекул в продукции АФК фагоцитами крови при действии экзогенного БТШ70 и ЛПС
3.5.1.1. Влияние ингибитора фосфолипазы С 1173122 на продукцию АФК нейтрофилами и моноцитами
3.5.1.2. Влияние ингибиторов фосфатидилинозитол 3-киназы (РІЗК) вортманнина (тог1:таппіп) и ЬУ294002 на продукцию АФК нейтрофилами и моноцитами
3.5.1.3. Влияние ингибиторов МАРК на продукцию АФК
нейтрофилами и моноцитами
3.5.1.2. Влияние ингибитора ММсВ Вау-11-7082 на продукцию АФК нейтрофилами и моноцитами
3.5.2. Влияние ингибитора ОТ-кВ Вау 11-7082 на секрецию ТЫР-а фагоцитами крови
ВЫВОДЫ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Белки - клиенты БТШ70 достаточно разнообразны, что обеспечивается низкой селективностью последовательности субстрат — связывающего домена молекулы БТШ70, который связывается с гидрофобными областями субстрата, состоящими из неполярных аминокислот (Evans et al., 2010). Поскольку связывание БТШ70 с субстратом происходит за счет гидрофобного взаимодействия, с БТШ70 также могут связаться другие небелковые молекулы с экспозированными гидрофобными остатками, включая липид-содержащие соединения, такие как ЛПС и липопротеины (Tsan, Gao, 2009).
1.4.2. Внутриклеточные функции БТШ70
Внутриклеточные белки семейства БТШ70 функционируют как молекулярные шапероны, играя важную роль в поддержании белкового гомеостаза. Они ответственны за распознавание и связывание синтезирующихся полипептидных цепей и частично свернутых интермедиатов, помогают им принять нативную конформацию, предотвращая их агрегацию и неправильный фолдинг. Повышенная экспрессия стресс — индуцибельного БТШ70 увеличивает шансы клетки выжить при неблагоприятных условиях окружающей среды. В условиях стресса они стабилизируют внутриклеточные белки, предотвращая их денатурацию и агрегацию, участвуют в утилизации денатурированных белков и тем самым поддерживают жизнеспособность клетки до улучшения условий. Помимо этого, повышенные уровни БТШ70 в клетке после стресса обеспечивают защиту от последующих стрессовых воздействий (Evans et al., 2010; Tsan, Gao, 2009; Oilier, 2006).
Различные шаперонные функции БТШ70, выполняемые им как в нормальных условиях, так и в условиях стресса, можно суммировать следующим образом (Giraldo et al., 2010; Mayer, Bukau, 2005; Tsan, Gao, 2009; Evans et al., 2010; Diller, 2006; Soti, Csermely, 2007):
1. Сворачивание и сборка недавно синтезированных белков.